Учитывая сложность реакций убиквитина и деубикитинации внутри клеток, важно установить анализы in vitro с определенными очищенными компонентами. Это помогает понять механизмы убиквитинации и деубикитинации, а также определить, как мутации, связанные с генами, кодируют ферменты, ответственные за эту реакцию, могут вызывать болезни человека. Мы можем определить домены и мотивы в этих компонентах, которые управляют этими реакциями.
Мы также можем разработать высокую пропускную способность экрана анализы, которые могут быть использованы для проверки для малых ингибиторов молекулы, которые могут быть разработаны в качестве потенциальных терапевтических средств. Чтобы начатьлиз бактерий, добавить PMSF и антипротеазы коктейль в ледяной лиз буфер A.Add 25 миллилитров лиза буфера в бутылку, содержащую бактерии гранулы и повторно гранулы. Передача ликата, содержащего бактерии в трубку для sonication.
Используйте зонд звуковой для sonicate лисировать на 70% выход амплитуды в течение 30 секунд, четыре-пять раз. Затем центрифуга при 21 000 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации бактерий лизируют бисером GSH в течение пяти часов в соответствии с рукописью, передать бисер вместе с 10 миллилитров буфера в пустой колонке хроматографии.
Затем добавьте в колонку 1,5 миллилтера буфера А, содержащего 25 миллимолярный глутатион, и соберите элюцию под действием силы тяжести в 1,5 миллилитровые микротрубки. Повторите процедуру элюции четыре раза со свежим буфером А продолжить обработку элевации фракций в соответствии с рукописью. Для начала, resuspend Его-BAP1 и MBP-DEUBAD бактерий гранулы в 25 миллилтеров ледяной лиза буфер B.Mix 25 миллилитров каждого лизата и инкубировать на льду в течение 15 минут.
Sonicate, а затем центрифуга лисировать на 21000 раз г в течение 20 минут. После центрифугации лизата процфицировать лизат через фильтр шприца 0,45 микрометрового поры в бутылку и смешать его с бисером Nickel NTA. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию с встряхивания в течение пяти часов.
После этого, спина вниз бисера на 25000 раз г в течение трех минут. Используйте пипетку, чтобы сохранить супернатант в 50 миллилитров трубки, как поток до конца. Вымойте бисер пятью миллилтерами буфера B, содержащими 20 миллимолярдов имидазола, шесть раз с трехминутной центрифугой.
После последней стирки перенесите бисер с 10 миллилтерами буфера B в пустую колонку хроматографии и добавьте один миллилитр буфера B, содержащий 200 миллимолярный имидазол. Соберите элюцию под действием силы тяжести в 1,5 миллилитровые микротрубки, содержащие DTT и EDTA. Повторите процедуру элюции четыре раза и объединить желаемые эластимные фракции в 15 миллилитровую трубку.
Добавьте буфер C, чтобы разбавить элайтный комплекс три раза. Затем перенесите разбавленную элюцию в подготовленные бусы амилой в трубках и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию с тряской. Утром центрифуга трубки на 2500 раз г в течение трех минут и держать супернатант в 15 миллилитров трубки, как поток до конца.
Вымойте белок связанных бусин с пятью миллилтерами буфера C в течение пяти-шести раз. Затем добавьте 500 микролитров буфера D в очищенный комплекс His-BAP1/MBP-DEUBAD на амилозных агарозных бусинках, чтобы сделать 50%-ный раствор шарика. Перенесите 20 микролитров 50%-бидового раствора в трубку микроцентрифуга и добавьте 20 микролитров в два раза Laemmli Sample Buffer для SDS-PAGE и синего анализа Кумасси.
Храните оставшееся решение шарика при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования. После культуры HEK293T клетки, пластины 12 миллионов клеток в 20 миллилтеров полных средств массовой информации в 15 сантиметров культуры блюдо, за день до трансфекции. После одного дня, под капотом культуры клетки, аспирировать средства массовой информации и поставлять с 12 миллилитров сыворотки свободных средств массовой информации.
Трансфект клеток с 21 микрограммов pCDNA плоский-H2A с помощью 63 микролитров PEI на один миллиграмм на миллилитр. Через 12 часов, изменить для завершения среды. После сбора клеток в соответствии с рукописью, повторно использовать клеточные гранулы примерно в 10 томах буфера E, содержащего NEM для ингибирования deubiquitinases и инкубировать на льду в течение 20 минут.
После центрифугации при 3000 раз г в течение пяти минут, отбросить супернатант. Вымойте гранулы хроматина дважды с 10 томами буфера E, а затем мыть дважды с буфером F.Resuspend хроматина в пять миллилитров буфера F и лечить гранулы с микрококковой нуклеазы при концентрации трех единиц на миллилитр в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации перенесите 40 микролитров алицита смеси в 1,5 миллилитровую трубку для анализа нуклеосомных фрагментов ДНК.
Добавьте 40 микролитров фенол-хлороформа и 20 микролитров буфера загрузки ДНК в шесть раз. Вихрь и спина на 18000 раз г в течение двух минут. Затем перенесите 15 микролитров акальной фазы в гель 2%agarose для загрузки ДНК.
После остановки реакции и центрифугации в соответствии с рукописью, инкубировать растворимые хроматин фракции с анти-флаг смолы бусы в 15 миллилитров трубки ночь на четыре градуса по Цельсию со тряской. Вымойте бисер шесть раз буфером G.Transfer шарики с пятью миллилтерами буфера G в пустую колонку хроматографии. Разбавить связанные нуклеосомы шарика 260 микролитров буфера G, содержащих 200 микрограмм на миллилитр пептида флага elution и от одного до пяти один моляр Tris на рН восемь.
Elute нуклеосомы три раза, один час в холодной комнате. Для выполнения анализа убиквитина сначала добавьте один микрограмм очищенных нуклеосом в 40 микролитров буфера H.После этого добавьте в трубку смесь ферментного раствора, содержащую 250 нанограммов UBE1, 672 нанограмма конъюгирования ферментов UB и E2 UB и один микрограмм комплекса ubiquitin ligase BMI1-RING1B E3. Инкубации реакции в течение трех часов при 37 градусов по Цельсию с редкими встряхивания.
Остановите реакцию, добавив 40 микролитров в два раза Laemmli Образец буфера и проанализировать гистон H2AK119 убиквитина западной blotting. Для выполнения анализа деубикитинации in vitro проводится повторное распространение очищенных нуклеосом в 40 микролитров буфера I и один микрограмм бактерий, очищенных его-BAP1/MBP-DEUBAD бисером. Поместите трубку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов, чтобы выполнить реакцию деубикитинации с редким встряхиванием.
Затем остановить реакцию, добавив 40 микролитров в два раза Laemmli буфера и анализировать с помощью иммуноблоттинга. В этом эксперименте, Coomassie синий окрашивания для типичной очистки комплекса GST-BM1-RING1B с использованием GST сродство шарики, показывает, что полосы мигрируют при ожидаемом весе моляра около 45 килодалтонов и 13 килодальтонов соответственно. Аналогичным образом очистка комплекса Его-BAP1 MBP-DEUBAD также привела к относительно высоким однородным препаратам с полосами около 90 килодальтонов и 55 килодалтонов соответственно.
С другой стороны, очищенная нуклеосомная фракция по существу состоит из 147 базовых парных полос, указывающих на наличие высокообогащенной мононуклеосомной фракции. Coomassie синий окрашивания очищенных нуклеосом показывает типичный шаблон полосы из четырех оттенков подразделений с стоихиометрическими количествами. Убиквитина гистона H2A с комплексом BMI1-RING1B показывает время зависимого увеличения убиквитинированной формы белка, в то время как уровни неизмененной формы сопутствуют снижению.
Реакция убиквитина является общей, так как практически все белки H2A преобразуются в H2A K119ub. С другой стороны, анализ деубикитинации проводился родными нуклеосомами. После инкубации этих нуклеосом с BAP1-DEUBAD наблюдалось время зависимого снижения сигнала H2A K119ub.
Успех реакций убиквитина и деубикитинации зависит от способа очистки белка. Нам нужен хороший урожай и использование буфера для повторного незаменимия и очистки белка должно быть совместимо с биохимическими реакциями. Когда это убиквитинация и deubiquitination анализы хорошо установлены, мы можем проверить аффект активаторов и ингибиторов, а также влияние заболеваний, связанных с генными мутациями.
Этот метод был создан при участии нескольких лабораторий и очень полезен для понимания механизмов убиквитинации и деубикитинации. Несколько химических веществ являются опасными и должны быть манипулировать в капюшоне. К ним относятся фенол-хлороформ, кислоты, основания и уменьшая агенты.
