Data la complessità delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione all'interno delle cellule è importante stabilire saggi in vitro con componenti purificati definiti. Questo aiuta a comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione e anche a determinare come le mutazioni associate ai geni che codificano gli enzimi responsabili di questa reazione possono causare malattie umane. Possiamo identificare i domini e i motivi in questi componenti che guidano queste reazioni.
Possiamo anche sviluppare test dello schermo ad alta produttività che possono essere utilizzati per lo schermo per inibitori di piccole molecole che possono essere sviluppati come potenziali terapie. Per iniziare la lisi batterica, aggiungere PMSF e cocktail antiproteasi nel tampone di lisi ghiacciata A.Aggiungere 25 millilter del tampone di lisi A nella bottiglia contenente pellet batterico e rimescolare il pellet. Trasferire il lisato contenente batteri in un tubo per la sonicazione.
Utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare il lisato con un'ampiezza di uscita del 70% per 30 secondi, da quattro a cinque volte. Quindi centrifugare a 21.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver incubato il batterio lisciviato con perline GSH per cinque ore secondo il manoscritto, trasferire le perline insieme a 10 millilter di tampone in una colonna cromatografica vuota.
Quindi, aggiungere 1,5 millilter di tampone A contenente 25 glutatione millimolare nella colonna e raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte con tampone fresco A un trattamento continuo delle frazioni eluizzate secondo il manoscritto. Per iniziare, rimescolare il pellet batterico His-BAP1 e MBP-DEUBAD in 25 millilter di tampone di lisi ghiacciata B.Mescolare 25 millilter di ogni lisato e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
Sonicare e poi centrifugare il lisato a 21.000 volte g per 20 minuti. Dopo la centrifugazione del lysate, filtrare il lysate attraverso un filtro siringa a poro da 0,45 micrometri in una bottiglia e mescolarlo con le perline Nickel NTA. Incubare a quattro gradi Celsius tremando per cinque ore.
Dopodi tempo, gira giù per le perline a 25.000 volte g per tre minuti. Utilizzare una pipetta per salvare il supernatante in un tubo da 50 millilitri man mano che il flusso scorre. Lavare le perline con cinque millilter di tampone B, contenenti 20 imidazolo millimolare, sei volte con centrifuga di tre minuti.
Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline con 10 millilter di tampone B in una colonna cromatografica vuota e aggiungere un millilitro di tampone B contenente 200 millimolare imidazolo. Raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri contenenti DTT ed EDTA. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte e mettere in comune le frazioni eluizzate desiderate in un tubo da 15 millilitri.
Aggiungere il buffer C per diluire il complesso eluitato tre volte. Quindi trasferire l'eluizione diluita alle perline di amilosio preparate in tubi e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Al mattino, centrifuga i tubi a 2.500 volte g per tre minuti e mantieni il supernatante in un tubo da 15 millilitri mentre fluiscono.
Lavare le perline legate alla proteina con cinque millilter di tampone C per cinque o sei volte. Aggiungere quindi 500 microlitri di tampone D al complesso Depurato His-BAP1/MBP-DEUBAD sulle perline di agarosio amilosio per creare una soluzione di tallone al 50%. Trasferire 20 microlitri della soluzione di perline al 50% su un tubo di microcentrifugo e aggiungere 20 microlitri di tampone campione Laemmli due volte per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie.
Conservare la soluzione di perline rimanente a meno 80 gradi Celsius per un utilizzo futuro. Dopo aver coltura le cellule HEK293T, placcare 12 milioni di cellule in 20 millilter di mezzi completi in un piatto di coltura di 15 centimetri, un giorno prima della trasfezione. Dopo un giorno, sotto la cappa di coltura cellulare, aspirare i mezzi e fornire 12 millilter di mezzi senza siero.
Trasfetto le cellule con 21 microgrammi di pCDNA flat-H2A utilizzando 63 microlitri di PEI a un milligrammo per millilitro. Dopo 12 ore, passare al mezzo completo. Dopo aver raccolto le cellule secondo il manoscritto, rimescolare il pellet cellulare in circa 10 volumi di tampone E contenente NEM per inibire le deubiquitinasi e si incuba sul ghiaccio per 20 minuti.
Dopo la centrifugazione a 3.000 volte g per cinque minuti, scartare il supernatante. Lavare il pellet di cromatina due volte con 10 volumi di tampone E prima e poi lavare due volte con tampone F.Resuspend la cromatina in cinque millilter del tampone F e trattare il pellet con nucleasi micrococcica alla concentrazione di tre unità per millilitro per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, trasferire un'aliquota di 40 microlitri della miscela in un tubo da 1,5 millilitri per l'analisi di frammenti di DNA nucleosomico.
Aggiungere 40 microlitri di fenolo-cloroformio e 20 microlitri di tampone di carico del DNA sei volte superiore. Vortice e rotazione a 18.000 volte g per due minuti. Quindi trasferire 15 microlitri della fase acquosa in un gel di agarosio al 2% per caricare il DNA.
Dopo aver interrotto la reazione e la centrifugazione secondo il manoscritto, incubare la frazione solubile di cromatina con perline di resina anticarro in un tubo da 15 millilitri durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Lavare le perline sei volte con tampone G.Trasferire le perline con cinque millilter di tampone G in una colonna cromatografica vuota. Diluire i nucleosomi legati del tallone con 260 microlitri di tampone G contenenti 200 microgrammi per millilitro di peptide di eluizione della bandiera e da uno a cinque tris molare a pH otto.
Elute i nucleosomi tre volte, un'ora nella stanza fredda. Per eseguire il test di ubiquitinazione, aggiungere prima un microgrammo dei nucleosomi purificati in 40 microlitri di tampone H.Successivamente, aggiungere una miscela di soluzione enzimatica contenente 250 nanogrammi di UBE1, 672 nanogrammi di enzimi coniuganti UB ed E2 UB e un microgrammo di complesso di ubiquitina ligasi BMI1-RING1B E3 nel tubo. Incubare la reazione per tre ore a 37 gradi Celsius con occasionali scosse.
Interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di due volte Laemmli Sample Buffer e analizzare l'ubiquitinazione dell'istono H2AK119 mediante macchia occidentale. Per eseguire il saggio di deubiquitinazione in vitro riprendo i nucleosomi purificati in 40 microlitri del tampone I e un microgrammo di batteri purificavano le perline His-BAP1/MBP-DEUBAD. Posizionare il tubo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre ore per eseguire la reazione di deubiquitinazione con agitazioni occasionali.
Quindi interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di tampone Laemmli due volte e analizzare mediante immunoblotting. In questo esperimento, la colorazione blu coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BM1-RING1B usando perline di affinità GST, mostra che le bande migrano al peso molare previsto rispettivamente intorno a 45 kilodalton e 13 kilodalton. Allo stesso modo, la purificazione del complesso His-BAP1 MBP-DEUBAD ha anche portato a preparazioni omogenee relativamente elevate con bande rispettivamente di circa 90 kilodalton e 55 kilodaltoni.
D'altra parte la frazione nucleosomica purificata è essenzialmente composta da una banda di 147 coppie di basi che indica la presenza di frazione mononucleosomiale altamente arricchita. La colorazione blu coomassie dei nucleosomi purificati mostra un tipico modello a banda delle quattro subunità istono con quantità stechiometriche. L'ubiquitinazione dell'istone H2A con il complesso BMI1-RING1B mostra un aumento dipendente dal tempo della forma ubiquitinata della proteina mentre i livelli della forma non modificata sono concomitanti diminuiti.
La reazione di ubiquitinazione è totale in quanto praticamente tutte le proteine H2A vengono trasformate in H2A K119ub. D'altra parte, il saggio di deubiquitinazione è stato condotto nucleosomi nativi. Dopo l'incubazione di questi nucleosomi con BAP1-DEUBAD è stata osservata una riduzione dipendente dal tempo del segnale H2A K119ub.
Il successo delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione dipende dal modo in cui la proteina viene purificata. Abbiamo bisogno di una buona resa e l'uso tampone per la resuspensione e la purificazione delle proteine dovrebbe essere compatibile con le reazioni biochimiche. Quando questi test di ubiquitinazione e deubiquitinazione sono ben consolidati, possiamo testare gli attivatori e gli inibitori dell'effetto delle mutazioni geniche associate alla malattia.
Questo metodo è stato stabilito con il contributo di diversi laboratori e sono molto utili per comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Diverse sostanze chimiche sono pericolose e devono essere manipolate nel cofano. Questo include fenolo-cloroformio, acidi, basi e agenti riducenti.
