Hücrelerin içinde ubiquitination ve deubiquitination reaksiyonların karmaşıklığı göz önüne alındığında tanımlanmış saflaştırılmış bileşenleri ile in vitro tahliller kurmak önemlidir. Bu, her yerde bulunan ve deubiquitinasyon un mekanizmalarını anlamaya ve aynı zamanda bu reaksiyondan sorumlu enzimleri kodlayan genlerle ilişkili mutasyonların insan hastalığına nasıl yol açabileceğini belirlemeye yardımcı olur. Bu reaksiyonları yönlendiren bu bileşenlerdeki etki alanlarını ve motifleri tanımlayabiliriz.
Ayrıca potansiyel terapötik olarak geliştirilebilir küçük molekül inhibitörleri için ekran için kullanılabilecek yüksek iş-iş verme ekranı tahlilleri geliştirebilirsiniz. Bakteri lysis başlamak için, buz soğuk lysis tampon A.Add 25 mililters lysis tampon A içine pmsf ve antiproteaz kokteyl ekleyin şişe bakteri pelet içeren içine a ve pelet resuspend. Sonication için bir tüp içinde lysate içeren bakterileri aktarın.
Lysate'yi 30 saniye, 4-5 kez %70 çıkış genliğinde sonicate etmek için sonda sonicator kullanın. Sonra 21, 000 kez g santrifüj 4 santigrat derece 20 dakika için. El yazmasına göre bakterileri GSH boncukları ile beş saat kuluçkaya yattıktan sonra, 10 milimetrik tampon ile birlikte boncukları boş bir kromatografi sütununa aktarın.
Daha sonra, sütuniçine 25 milimolar glutatyon içeren tampon A 1.5 mililters ekleyin ve 1.5 mililitre mikrotüpler içine yerçekimi tarafından elüsyon toplamak. Taze tampon ile elüsyon işlemini dört kez tekrarlayın El yazmasına göre eluted kesirlerin tedavisine devam edin. Başlamak için, His-BAP1 ve MBP-DEUBAD bakteri peletlerini 25 mililters buz soğuk lysis tampon B.Mix 25 mililters her lysate ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
Sonicate ve sonra 20 dakika için 21, 000 kez g lysate santrifüj. Lysate santrifüjden sonra, 0,45 mikrometrelik gözenek şırınga filtresinden bir şişeye süzün ve Nikel NTA boncukları ile karıştırın. Dört derecede inkübasyon beş saat boyunca sallayarak.
Bundan sonra, üç dakika için 25, 000 kez g boncuk aşağı spin. Aktığı için 50 mililitrelik bir tüpiçinde supernatant kaydetmek için bir pipet kullanın. Tampon B beş mililters ile boncukyı yıkayın, içeren 20 milimolar imidazol, üç dakikalık santrifüj ile altı kez.
Son yıkamadan sonra, boş bir kromatografi sütuniçine tampon B 10 mililters ile boncuk transfer ve 200 milimolar imidazol içeren tampon B bir mililitre ekleyin. DTT ve EDTA içeren 1,5 mililitrelik mikrotüpler içine yerçekimi tarafından elution toplamak. Elüsyon işlemini dört kez tekrarlayın ve istenilen eluted fraksiyonları 15 mililitrelik bir tüpe birleştirin.
Eluted kompleksi üç kez seyreltmek için tampon C ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş elution tüpler içinde hazırlanan amylose boncuk ve sallayarak dört derece santigrat gecede kuluçka aktarın. Sabahları tüpleri 2,500 kez üç dakika bekletin ve süpernatant'ı 15 mililitrelik bir tüpte akıp doğru layın.
Proteine bağlı boncukları beş ila altı kez beş ila altı kez tampon C mililters ile yıkayın. Daha sonra amylose agarose boncuklar üzerinde saflaştırılmış His-BAP1/MBP-DEUBAD kompleksine tampon D 500 mikrolitre ekleyin 50% boncuk çözeltisi yapmak. Bir mikrosantrifüj tüpüne %50 boncuk çözeltisinin 20 mikrolitresini aktarın ve SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için iki kez Laemmli Örnek Tampon 20 mikrolitre ekleyin.
Kalan boncuk çözeltisini gelecekteki kullanım için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kültürden sonra HEK293T hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce, 15 santimetrelik bir kültür yemeğine 20 mililters tam ortam da 12 milyon hücreyi kaplar. Bir gün sonra, hücre kültürü başlık altında, aspire medya ve serum ücretsiz medya 12 mililters ile kaynağı.
Mililitre başına bir miligram da 63 mikrolitre PEI kullanarak 21 mikrogram pCDNA düz H2A ile hücreleri transfect. 12 saat sonra, tam orta değiştirin. El yazmasına göre hücreleri hasat ettikten sonra, deubiquitinazları inhibe etmek için NEM içeren yaklaşık 10 ciltlik tampon E'deki hücre peletini yeniden askıya alın ve 20 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
Santrifüjden sonra 3, 000 kez g beş dakika, supernatant atın. Önce 10 hacimli tampon E ile kromatin peletini iki kez yıkayın ve sonra tampon F'nin beş mililters içinde kromatini tampon F ile iki kez yıkayın ve peleti oda sıcaklığında mililitre başına üç birim konsantrasyonda mikrokokal çekirdeğe göre tedavi edin. Kuluçkadan sonra, nükleozomal DNA parçalarının analizi için karışımın 40 mikrolitrelik aliquot'unu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
40 mikrolitre fenol-kloroform ve 20 mikrolitre altı kez DNA yükleme tampon ekleyin. Girdap ve iki dakika için 18, 000 kez g spin. Daha sonra 15 mikrolitre sulu fazı %2 agarose jel ile DNA'yı yükleyin.
El yazmasına göre reaksiyon ve santrifüjü durdurduktan sonra, çözünen kromatin fraksiyonunu, bir gecede dört derece santigrat derecede anti-bayrak rezorba boncuklarla ıslatın. Bedaları tampon G.Transfer ile altı kez yıkayın boncukları beş mililters tampon G ile boş bir kromatografi sütununa aktarın. Boncuk bağlı nükleozomları, bayrak elüsyon peptidin mililitresi başına 200 mikrogram ve pH sekizde 1 ila beş tane bir molar Tris içeren 260 mikrolitre tampon G ile seyreltin.
Nükleozomları üç kez, soğuk odada bir saat. Ubikitinasyon testi gerçekleştirmek için, ilk tampon H.Bundan sonra 40 mikrolitre saflaştırılmış nükleozomların bir mikrogram ekleyin, ube1 250 nanogram içeren bir enzim çözeltisi karışımı ekleyin, UB ve E2 UB konjuge enzimler 672 nanogram ve bmi1-RING1B E3 ubiquitin ligaz kompleksi bir mikrogram. Reaksiyonu 37 santigrat derecede üç saat boyunca ara sıra sallayarak kuluçkaya yatırın.
İki kez Laemmli Örnek Tampon 40 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun ve batı blotting tarafından histon H2AK119 her yerde analiz. In vitro deubiquitination dosay gerçekleştirmek için tampon I 40 mikrolitre saflaştırılmış nükleozomlar resuspend ve bakteri bir mikrogram His-BAP1/MBP-DEUBAD boncuk saflaştırılmış. Zaman zaman sallayarak deubiquitinasyon reaksiyonu yürütmek için üç saat boyunca 37 santigrat derece bir kuvöz de tüp yerleştirin.
Daha sonra iki kez Laemmli tampon 40 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurmak ve immünoblotting ile analiz. Bu deneyde, GST afinite boncuklar kullanarak GST-BM1-RING1B kompleksinin tipik bir arınma için Coomassie mavi boyama, bantları sırasıyla 45 kilodalton ve 13 kilodalton civarında beklenen azı dakika ağırlığında göç gösterir. Benzer şekilde His-BAP1 MBP-DEUBAD kompleksinin saflaştırılması da sırasıyla 90 kilodalton ve 55 kilodalton civarında bantları ile nispeten yüksek homojen preparatlar sonuçlandı.
Öte yandan saflaştırılmış nükleozomal fraksiyonu aslında yüksek oranda zenginleştirilmiş mononükleozomal fraksiyonun varlığını gösteren 147 baz çifti bandı ile oluşur. Saflaştırılmış nükleozomların Coomassie mavi boyama stokiyometrik miktarları ile dört histon alt birimlerin tipik bir bant deseni gösterir. Histon H2A'nın BMI1-RING1B kompleksi ile ubikitinasyonu, proteinin her yerde bulunan formunun zamana bağlı olarak arttığını, değiştirilmemiş form düzeylerinin ise eşlik eden bir şekilde azaldığını göstermektedir.
Hemen hemen tüm H2A proteinleri H2A K119ub dönüştürülür gibi ubikitinasyon reaksiyonu toplamdır. Öte yandan, deubiquitination dosay yerli nükleozomlar yapıldı. Bu nükleozomların BAP1-DEUBAD ile inkübasyonundan sonra H2A K119ub sinyalinin zamana bağlı olarak azalması gözlendi.
Ubiquitination ve deubiquitination reaksiyonlarının başarısı protein saflaştırılmış şekilde bağlıdır. Biz iyi bir verim gerekir ve protein resuspension ve arıtma için tampon kullanımı biyokimyasal reaksiyonlar ile uyumlu olmalıdır. Bu ubiquitination ve deubiquitination tahlilleri iyi tespit edildiğinde biz etki aktivatörleri ve inhibitörleri yanı sıra hastalık ilişkili gen mutasyonlarının etkisini test edebilirsiniz.
Bu yöntem çeşitli laboratuvarların katkısı ile kurulmuştur ve her yerde bulunma ve deubiquitinasyon mekanizmalarını anlamak için çok yararlıdır. Çeşitli kimyasallar tehlikeli dir ve kaputta manipüle edilmesi gerekir. Bu fenol-kloroform, asitler, bazlar ve azaltıcı ajanlar içerir.
