Questo protocollo modulare consente di esplorare molteplici eventi molecolari resi da lipidi strutturali e di segnalazione, e/o RNA, in regioni tissutali discrete e nel sangue con una migliore produzione di dati quantitativi e qualitativi per campione campione. Il metodo è applicabile a qualsiasi modello sperimentale e può essere applicato anche a campioni di tessuto umano e sangue. A dimostrare la procedura saranno Claudia Schwitter, un tecnico, Julia Post, una studentessa laureata, e Raissa Lerner, un postdoc nel mio gruppo.
Per iniziare, prendi cervelli precedentemente isolati, interi e congelati di topi con epilessia acuta e profilattica indotta da acido kainico. Montare i cervelli sul sistema di montaggio del criostato. Imposta lo spessore su 50 micrometri e taglia il cervello in modalità trim vicino alla regione di interesse.
Quando ci si avvicina alla regione di interesse, impostare lo spessore su 18-20 micrometri. Per localizzare la sottoregione di interesse, macchiare le fette di cervello usando il blu toluidina. Utilizzare un microscopio per ispezionare le fette macchiate per identificare le regioni di interesse da punzonare e utilizzare un atlante del topo come riferimento per trovare le regioni anatomiche cerebrali appropriate.
Utilizzare i corer campione per prelevare punzoni da 0,8 a 1,0 millimetri di diametro. Trasferire i punzoni per le coestratzioni di endocannabinoidi ed eicosanoidi in tubi ambrati da 2 millilitri pre-raffreddati con sette sfere di acciaio pre-raffreddate per tubo. Per la coestrazione di fosfolipidi ed endocannabinoidi, la doppia co-estrazione lipidica e RNA, trasferire i punzoni in tubi di estrazione privi di RNasi da 2 millilitri con perline ceramiche.
Pesare i punzoni congelati nella cella frigorifera e procedere immediatamente con l'estrazione o il congelamento a 80 gradi Celsius. Per eseguire la coestrazione lipidica liquido-liquida di endocannabinoidi ed eicosanoidi da pezzi di cervello, pugni o campioni di polvere di tessuto, posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e sette sfere di acciaio sul ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di MTBE ghiacciato e 50 microlitri di acqua acetonitrile contenenti gli standard interni.
Dopo aver aggiunto 400 microlitri di acido formico molare 0,1, utilizzare un liser tissutale per omogeneizzare per 30 secondi a 1 minuto. Centrifugare questo omogeneizzato per 15 minuti a 5.000 volte g a 4 gradi Celsius. Mettilo nel congelatore per 10 minuti a 80 gradi Celsius per congelare la fase inferiore acquosa, che faciliterà il trasferimento della fase organica superiore.
Trasferire la fase organica superiore in nuovi tubi ambrati da 1,5 millilitri, evaporare sotto un flusso delicato di azoto a 37 gradi Celsius per 10 minuti, quindi ricostituire in 50 microlitri di acqua acetonitrile per ulteriori analisi. Conservare la fase acquosa a 20 o 80 gradi Celsius per un'ulteriore analisi del contenuto proteico. Per coestrarre endocannabinoidi ed eicosanoidi da campioni di plasma, posizionare i campioni di plasma congelati sul ghiaccio e lasciarli scongelare completamente.
Aggiungere 800 microlitri di MTBE e 50 microlitri di acqua acetonitrile contenenti gli standard interni ottimizzati per lo spiking utilizzando campioni di plasma di riferimento. Aggiungere 600 microlitri di acido formico molare 0,1 e vortice a 4 gradi Celsius per 2 minuti. Centrifugare i campioni a 4.000 volte g per 15 minuti a 4 gradi Celsius.
Trasferire la fase organica in nuovi tubi. Evaporarlo sotto un delicato flusso di azoto a 37 gradi Celsius, quindi ricostituirlo con 50 microlitri di acqua acetonitrile per l'analisi di monitoraggio a reazione multipla della cromatografia liquida. Per eseguire la coestrazione di fosfolipidi ed endocannabinoidi da regioni del cervello, pugni o altri campioni di polvere di tessuto, posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e le perle di ceramica sul ghiaccio.
Aggiungere 800 microlitri di metil terz-butil etere e miscela di metanolo e 10 microlitri di metanolo contenenti gli standard interni. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acido formico allo 0,1% contenenti 25 tetraidrolipstatina micromolare / URB597 e 50 microgrammi per millilitro di BHT. Dopo l'omogeneizzazione con un omogeneizzatore tissutale, centrifugare a 5.000 volte g e 4 gradi Celsius per 15 minuti.
Trasferire la fase organica superiore in nuovi tubi, evaporare sotto un delicato flusso di azoto a 37 gradi Celsius e quindi ricostituire questo estratto lipidico con 90 microlitri di metanolo. Se si procede immediatamente, aggiungere il 10% di acqua a un'aliquota di estratto lipidico e iniettare 10 microlitri nella LC/MS per l'analisi dei fosfolipidi. Per ulteriori analisi endocannabinoidi, procedere con il passaggio successivo.
Prendere un'aliquota dell'estratto lipidico, evaporare a secco e ricostituire in acqua acetonitrile. Eseguire la doppia estrazione di RNA e lipidi e la coestrazione di fosfolipidi ed endocannabinoidi da campioni di tessuto, scongelare aliquote di polvere di tessuto o mazzi cerebrali a 4 gradi Celsius. Aggiungere il tessuto ai tubi di estrazione con perline di ceramica.
Quindi aggiungere 600 microlitri di tampone RLT insieme a 200 microlitri di cloroformio. Per la coestrazione di fosfolipidi ed endocannabinoidi, campioni spike con 10 microlitri di miscela standard interna e omogeneizzare ad alta velocità per 20 secondi. Trasferire campioni omogeneizzati in nuovi tubi centrifughi e centrifughe per cinque minuti a piena velocità e 4 gradi Celsius per consentire la separazione di fase.
Trasferire la fase superiore in un tubo fresco per l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit standard. Elute ha estratto l'RNA in un volume totale di 50 microlitri di acqua priva di RNasi e lo ha immagazzinato a 80 gradi Celsius. Per l'estrazione lipidica, aggiungere 800 microlitri di MTBE/metanolo e 200 microlitri di acido formico allo 0,1% alla fase inferiore contenente cloroformio.
Vortice per 45 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire la fase organica superiore in un nuovo tubo. Evaporalo sotto un leggero flusso di azoto a 37 gradi Celsius.
Per ulteriori analisi LC/MS, ricostituire il campione in 90 microlitri di metanolo e conservarlo a 20 o 80 gradi Celsius, oppure procedere immediatamente all'analisi. Per ulteriori analisi endocannabinoidi, procedere con il passaggio successivo. Prendere un'aliquota dell'estratto lipidico, evaporare a secco e ricostituire in acqua acetonitrile.
Quindi, iniettare 20 microlitri nella LC / MS per l'analisi degli endocannabinoidi. L'induzione dell'acido kainico delle crisi epilettiche acute ha portato ad una massima intensità di convulsioni un'ora dopo l'iniezione. La profilazione lipidomica di endocannabinoidi ed eicosanoidi, così come fosfolipidi ed endocannabinoidi, mostra cambiamenti del livello lipidico attraverso la corteccia cerebrale, lo striato, la regione talamica, l'ippocampo, l'ipotalamo, il cervelletto e il tessuto cardiaco e polmonare nei topi epilettici indotti dall'acido kainico e nei controlli.
Dopo la doppia estrazione di fosfolipidi ed endocannabinoidi e RNA per la profilazione quantitativa dei pugni cerebrali dei topi, è stata analizzata la distribuzione quantitativa dei lipidi nell'ipotalamo, nell'amigdala basolaterale e nell'ippocampo ventrale e dorsale. Livelli di espressione relativa di enzimi e recettori endogeni coinvolti nella segnalazione lipidica, nonché marcatori per l'attività cerebrale studiati a livello di mRNA in diverse regioni del cervello e sottoregioni di topi sottoposti a crisi epilettiche indotte da acido kainico e controlli. L'epilessia indotta dall'acido kainico ha causato una massiccia perdita del segnale NeuN, prevalentemente nella regione CA1, CA3 e hilus dell'ippocampo, accompagnata da eventi apoptotici indicati dal segnale caspasi-3 rispetto ai topi iniettati con soluzione salina di controllo.
Dopo il trattamento con palmitoiletanolamide subcronica, il segnale della proteina nucleiale neuronale è stato notevolmente preservato e il segnale CASP3 era a malapena rilevabile. La punzonatura cerebrale e la dissezione di aree cerebrali discrete sono piuttosto impegnative e richiedono abilità fini per ottenere un campionamento coerente tra più coorti. Pertanto, la pratica sugli organi di prova e una buona conoscenza della morfologia del cervello sono altamente raccomandate.
