이 모듈식 프로토콜을 사용하면 지질 및/또는 RNA, 신중한 조직 영역 및 샘플 시편당 향상된 정량적 및 질적 데이터 출력을 갖춘 혈액에서 구조 및 신호 지질 및/또는 RNA에 의해 렌더링되는 여러 분자 이벤트를 탐색할 수 있습니다. 이 방법은 모든 실험 모델에 적용되며 인간 조직 표본 및 혈액에도 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 클라우디아 슈비터, 기술자, 줄리아 포스트, 졸업생, 그리고 라이사 러너, 내 그룹의 포스트 독이 될 것입니다.
시작하려면, 급성 및 예방 처리 카이닉 산 유도 간질을 가진 마우스의 이전에 고립 된, 전체, 냉동 뇌를. 뇌를 극저온의 장착 시스템에 장착합니다. 두께를 50 마이크로미터로 설정하고 관심 영역과 가까운 트림 모드에서 뇌를 슬라이스합니다.
관심 영역에 접근할 때 두께를 18 내지 20 마이크로미터로 설정합니다. 관심의 하위 영역을 국소화하기 위해, 토루이딘 블루를 사용하여 뇌 슬라이스 얼룩. 현미경을 사용하여 얼룩진 조각을 검사하여 주먹으로 볼 수 있는 관심 영역을 식별하고 마우스 아틀라스를 참조하여 적절한 뇌 해부학 적 영역을 찾습니다.
샘플 코러스를 사용하여 직경 0.8~1.0mm의 펀치를 사용하십시오. 엔도칸 나비 노이드와 에리코사노이드 코추출에 대한 펀치를 튜브 당 7 개의 미리 냉각 된 강철 볼로 미리 냉각 된 2 밀리리터 호박 색 튜브로 옮긴다. 인지질 및 엔도칸 나비노이드 코추출, 듀얼 지질 및 RNA 공동 추출의 경우, 세라믹 구슬이 있는 2밀리리터 RNase 프리 추출 튜브로 펀치를 옮기습니다.
차가운 방에서 냉동 펀치의 무게와 즉시 추출 또는 섭씨 80도에서 동결 진행합니다. 뇌 조각, 펀치 또는 조직 분말 샘플에서 엔도 칸 나비 노이드와 eicosanoids의 액체 액체 지질 co추출을 수행하려면, 얼음에 조직 샘플과 일곱 강철 공을 포함하는 추출 튜브를 배치합니다. 600 마이크로리터의 얼음 차가운 MTBE와 내부 표준을 포함하는 아세토닐레 물 50마이크로리터를 추가합니다.
0.1 어금니 포름산의 400 마이크로리터를 추가한 후, 조직 용액을 사용하여 30초에서 1분 동안 균질화합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 5, 000배에서 15분 동안 이 동종포를 합니다. 80°C에서 10분 동안 냉동실에 넣어 수성 하면을 동결하여 상부 유기상 의 전적을 용이하게 합니다.
상부 유기상을 새로운 1.5 밀리리터 호박색 튜브로 옮기고, 10분 동안 섭씨 37도에서 부드러운 질소 스트림 하에서 증발한 다음, 아세토나이트 수의 50마이크로리터로 재구성하여 추가 분석을 수행합니다. 추가 단백질 함량 분석을 위해 수성 상을 섭씨 20도 또는 80도에 저장하십시오. 플라즈마 샘플에서 엔도칸 나비노이드와 에리코사노이드를 코추출하려면 냉동 플라즈마 샘플을 얼음에 놓고 완전히 해동하십시오.
MTBE 800 마이크로리터와 참조 플라즈마 샘플을 사용하여 스파이크에 최적화된 내부 표준을 포함하는 50마이크로리터의 아세토나이트 워터를 추가합니다. 600 마이크로리터의 0.1 어금니 포름산과 소용돌이를 섭씨 4도에서 2분간 첨가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000배 g에서 원심분리합니다.
유기 상을 새로운 튜브로 옮기. 37섭씨에서 질소의 부드러운 스트림에서 증발한 다음 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링 분석을 위해 50 마이크로리터의 아세토나이트 워터로 재구성합니다. 뇌 영역, 펀치 또는 기타 조직 분말 샘플에서 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드의 공동 추출을 수행하려면, 얼음에 조직 샘플과 세라믹 구슬을 포함하는 추출 튜브를 배치합니다.
메틸 테르부틸 에테르와 메탄올 혼합물 800 마이크로리터와 내부 표준을 포함하는 메탄올 10 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 25 마이크로몰라 테트라하이드로립스타틴/URB597 및 BHT 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 0.1%의 마이크로리터를 추가합니다. 조직 균질화로 균질화 한 후 원심분리기는 5, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안.
상부 유기상을 새로운 튜브로 옮기고, 37°C에서 부드러운 질소 스트림 에서 증발한 다음, 메탄올 의 마이크로리터 90마이크로리터로 이 지질 추출물을 재구성합니다. 즉시 진행하는 경우, 지질 추출물의 알리쿼트에 10%의 물을 추가하고 인지질 분석을 위해 LC/MS에 10마이크로리터를 주입한다. 추가 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 다음 단계를 진행하십시오.
지질 추출물의 알리쿼트(aliquot)를 취하고, 건조함으로 증발하고, 아세토닐리(acetonitrile) 물로 재구성하십시오. 조직 샘플에서 RNA와 지질의 이중 추출 및 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드의 공동 추출을 수행하기 위해, 4 섭씨에서 조직 분말 알리쿼트 또는 뇌 무리를 해동. 세라믹 구슬을 사용하여 추출 튜브에 조직을 추가합니다.
그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼과 함께 RLT 버퍼 600 마이크로리터를 추가합니다. 인지질 및 엔도칸 나비노이드 코추출의 경우 내부 표준 혼합물 10 마이크로리터가 있는 스파이크 샘플을 스파이크하고 20초 동안 고속으로 균질화합니다. 균질화된 샘플을 새로운 원심분리기 튜브및 원심분리기로 5분간, 섭씨 4도로 옮겨 위상 분리를 가능하게 합니다.
표준 키트를 사용하여 RNA 추출을 위한 상층부를 신선한 튜브로 옮는다. Elute는 총 50마이크로리터의 RNase 없는 물로 RNA를 추출하여 섭씨 80도에 보관했습니다. 지질 추출의 경우 MTBE/메탄올 800마이크로리터와 0.1%의 마이크로리터를 하부 클로로폼 함유 상에 첨가합니다.
섭씨 4도에서 45분 간 소용돌이를 즐길 수 있습니다. 상부 유기 상을 새로운 튜브로 옮기. 섭씨 37도에서 질소의 부드러운 스트림에서 증발.
추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올 90 마이크로리터로 샘플을 재구성하고 섭씨 20도 또는 80도에 저장하거나 즉시 분석을 진행합니다. 추가 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 다음 단계를 진행하십시오. 지질 추출물의 알리쿼트(aliquot)를 취하고, 건조함으로 증발하고, 아세토닐리(acetonitrile) 물로 재구성하십시오.
그런 다음 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 LC / MS에 20 마이크로 리터를 주입하십시오. 급성 간질 발작의 Kainic 산 유도는 최대 발작 강도 1 시간 후 주입을 주도. 내피칸 나비 노이드와 에이코사노이드의 지질 프로파일링은 물론 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드는 대뇌 피질, 죽상 류, 시상 하부, 소뇌뿐만 아니라 카이닉 산 유도 간질 및 폐 조직에서 지질 수준 변화를 보여줍니다.
마우스 뇌 펀치의 정량 프로파일링을 위한 인지질 및 엔도칸나비노이드 및 RNA의 이중 추출 후 시상하부내 지질의 정량적 분포, 바소포탈 편도체 및 복부 및 등대 해마를 분석했다. 지질 신호에 관여하는 내인성 효소 및 수용체의 상대적 발현 수준뿐만 아니라 카이닉산 유도 간질 발작 및 대조를 거친 마우스의 다른 뇌 영역 및 하위 영역에서 mRNA 수준에서 조사된 뇌 활동에 대한 마커. 카이닉산 유도 간질은 주로 해마의 CA1, CA3 및 힐루스 지역에서 NeuN 신호의 대규모 손실을 일으켰으며, 대조군 식염수 주입 마우스에 비해 caspase-3 신호로 표시된 세포질 이벤트를 수반하였다.
아만성 팔미토일레탄올라미드로 치료한 후, 뉴런 핵 단백질 신호가 눈에 띄게 보존되었고 CASP3 신호는 거의 감지되지 않았다. 뇌 펀칭 및 신중한 뇌 영역의 해부는 매우 도전적이고 여러 코호트에 걸쳐 일관된 샘플링을 얻기 위해 좋은 기술이 필요합니다. 따라서, 테스트 장기에 연습 하 고 뇌 형태에 대 한 좋은 지식은 매우 권장.
