このモジュラープロトコルにより、構造的およびシグナル伝達脂質、および/またはRNAによってレンダリングされた複数の分子事象を、控えめな組織領域および血液中で探索することが可能になり、サンプル試料あたりの定量的および定性的データ出力が改善されます。この方法は、任意の実験モデルに適用可能であり、ヒト組織標本および血液にも適用することができる。手順を実演するのは、技術者のクラウディア・シュヴィッター、大学院生のジュリア・ポスト、そして私のグループのポスドクであるライッサ・ラーナーです。
開始するには、急性および予防的に治療されたカイニン酸誘発てんかんを有するマウスの以前に単離された、全体、凍結された脳を採取する。クライオスタットの取り付けシステムに脳を取り付けます。厚さを50マイクロメートルに設定し、関心領域の近くでトリムモードで脳をスライスします。
関心領域に近づいたら、厚さを 18 ~ 20 マイクロメートルに設定します。関心のある部分領域を局在化するために、トルイジンブルーを用いて脳スライスを染色する。顕微鏡を使用して染色されたスライスを検査してパンチする関心領域を特定し、マウスアトラスを基準として使用して適切な脳解剖学的領域を見つけます。
サンプルコアラーを使用して、直径0.8〜1.0ミリメートルのパンチを採取します。エンドカンナビノイドとエイコサノイドの共抽出用のパンチを、チューブあたり7つの予冷スチールボールを備えた予冷された2ミリリットルのアンバーチューブに移します。リン脂質とエンドカンナビノイドの共抽出、二重脂質とRNAの共抽出の場合は、セラミックビーズでパンチを2ミリリットルのRNaseフリー抽出チューブに移します。
冷蔵室で凍結パンチの重量を量り、すぐに抽出を進めるか、摂氏80度で凍結します。脳片、パンチ、または組織粉末サンプルからエンドカンナビノイドおよびエイコサノイドの液液脂質共抽出を行うには、組織サンプルおよび7つの鋼球を含む抽出チューブを氷上に置く。内部標準物質を含む600マイクロリットルの氷冷MTBEおよび50マイクロリットルのアセトニトリル水を加える。
400マイクロリットルの0.1モルのギ酸を加えた後、組織溶解剤を使用して30秒〜1分間均質化する。このホモジネートを摂氏4度で5,000倍gで15分間遠心分離する。それを摂氏80度で10分間冷凍庫に入れて、水性下相を凍結させ、上部有機相の移動を容易にする。
上部有機相を新しい1.5ミリリットルのアンバーチューブに移し、摂氏37度で穏やかな窒素流下で10分間蒸発させた後、さらなる分析のために50マイクロリットルのアセトニトリル水で再構成する。水相を摂氏20度または80度に保存して、さらなるタンパク質含有量分析を行う。血漿サンプルからエンドカンナビノイドとエイコサノイドを共抽出するには、凍結した血漿サンプルを氷の上に置き、完全に解凍させます。
800マイクロリットルのMTBEおよび50マイクロリットルのアセトニトリル水を加え、参照血漿サンプルを使用したスパイク用に最適化された内部標準を含む。600マイクロリットルの0.1モルのギ酸を加え、摂氏4度で2分間渦を加える。サンプルを4, 000倍gで4°Cで15分間遠心分離する。
有機相を新しいチューブに移す。摂氏37度の穏やかな窒素気流下で蒸発させ、液体クロマトグラフィーの多重反応モニタリング分析のために50マイクロリットルのアセトニトリル水で再構成します。脳領域、パンチ、または他の組織粉末サンプルからリン脂質およびエンドカンナビノイドの共抽出を行うには、組織サンプルおよびセラミックビーズを含む抽出チューブを氷上に置く。
800マイクロリットルのメチルtert−ブチルエーテルおよびメタノール混合物および内部標準物質を含む10マイクロリットルのメタノールを加える。次に、25マイクロモルのテトラヒドロリプスタチン/ URB597および50マイクログラム/BHTを含む200マイクロリットルの0.1%ギ酸を加える。組織ホモジナイザーでホモジナイズした後、5,000倍gおよび4°Cで15分間遠心分離する。
上部有機相を新しいチューブに移し、摂氏37度の穏やかな窒素流下で蒸発させ、この脂質抽出物を90マイクロリットルのメタノールで再構成する。すぐに進行する場合は、脂質抽出物のアリコートに10%の水を加え、リン脂質分析のためにLC/MSに10マイクロリットルを注入する。さらなるエンドカンナビノイド分析のために、次のステップに進みます。
脂質抽出物のアリコートを取り、蒸発乾固させ、アセトニトリル水中で再構成する。組織サンプルからのRNAおよび脂質の二重抽出およびリン脂質およびエンドカンナビノイドの共抽出を行うには、組織粉末アリコートまたは脳房を摂氏4度で融解する。セラミックビーズで抽出チューブに組織を追加します。
次に、600マイクロリットルのRLT緩衝液を200マイクロリットルのクロロホルムとともに加える。リン脂質とエンドカンナビノイドの共抽出では、10マイクロリットルの内部標準混合物でサンプルをスパイクし、20秒間高速で均質化します。均質化されたサンプルを新しい遠沈管に移し、全速力で摂氏4度で5分間遠心分離して相分離を可能にします。
標準キットを使用してRNA抽出のために上相を新鮮なチューブに移す。抽出したRNAを50マイクロリットルのRNaseフリー水で溶出し、摂氏80度で保存する。脂質抽出のために、800マイクロリットルのMTBE/メタノールおよび200マイクロリットルの0.1%ギ酸をクロロホルム含有下の相に加える。
摂氏4度で45分間渦を巻き起こす。上部有機相を新しいチューブに移す。摂氏37度の穏やかな窒素の流れの下でそれを蒸発させる。
さらにLC/MS分析を行うには、サンプルを90マイクロリットルのメタノールで再構成し、20度または80°Cで保存するか、すぐに分析に進みます。さらなるエンドカンナビノイド分析のために、次のステップに進みます。脂質抽出物のアリコートを取り、蒸発乾固させ、アセトニトリル水中で再構成する。
次に、エンドカンナビノイド分析のためにLC / MSに20マイクロリットルを注入する。急性てんかん発作のカイニン酸誘導は、注射後1時間の最大発作強度をもたらした。エンドカンナビノイドおよびエイコサノイド、ならびにリン脂質およびエンドカンナビノイドのリピドミープロファイリングは、カイニン酸誘発てんかんマウスおよび対照における大脳皮質、線条体、視床領域、海馬、視床下部、小脳ならびに心臓および肺組織にわたる脂質レベルの変化を示す。
マウス脳パンチの定量的プロファイリングのためのリン脂質およびエンドカンナビノイドおよびRNAの二重抽出後、視床下部、側底側扁桃体、および腹側および背側海馬における脂質の定量的分布を分析した。脂質シグナル伝達に関与する内因性酵素および受容体の相対的発現レベル、ならびに脳活動のためのマーカーを、カイニン酸誘発てんかん発作に供したマウス由来の異なる脳領域および部分領域におけるmRNAレベルで調査した対照。カイニン酸誘発てんかんは、主に海馬のCA1、CA3、およびヒルス領域においてNeuNシグナルの大規模な損失を引き起こし、対照生理食塩水注射マウスと比較してカスパーゼ-3シグナルによって示されるアポトーシス事象を伴った。
亜慢性パルミトイルエタノールアミドによる処理後、ニューロン核タンパク質シグナルは顕著に保存され、CASP3シグナルはほとんど検出できなかった。脳のパンチングと控えめな脳領域の解剖は非常に困難であり、複数のコホートにわたって一貫したサンプリングを得るためには細かいスキルが必要です。したがって、検査臓器での練習と脳の形態に関する十分な知識を強くお勧めします。
