وضعنا إجراء لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية, نادرة متخصصة الخلايا الظهارية الكيميائي من الفئران الفلورية الكولين أستيل. ويستند هذا الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من submucosa السماح لاحتضان أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع papain. وهذا يسمح لاسترداد قوية من خلايا فرشاة القصبة الهوائية وقد استخدمت بنجاح لعزل وتحليل النسخ للخلايا فرشاة من قبل تسلسل الجيش الملكي النيبالي.
الحضانة الطويلة مع الانزيمات الهضمية يمكن أن تقلل من صلاحية الخلية وتغيير التشكيل الجانبي النسخي للخلايا المعزولة من الأنسجة. هنا نحن فصل ظهارة القصبة الهوائية مع dispase واحتضانها في وقت لاحق مع papain لفترة قصيرة من الزمن إنتاج غلة عالية من خلايا الفرشاة قابلة للحياة. يمكن أن تساهم طريقتنا في دراسات ظهارة مجرى الهواء العلوي.
يمكن تطبيق نفس البروتوكول على عزل خلايا الفرشاة عن مواقع الغشاء المخاطي الأخرى مثل أنسجة الأنف. سوف مظاهرة لدينا تقنية استنساخ للغاية تسمح للعلماء الأقران لعزل ومواصلة التحقيق في خلايا فرشاة القصبة الهوائية. لبدء هذا الإجراء، إضافة dispase وDNase الأول إلى برنامج تلفزيوني في التركيزات النهائية هو مبين هنا لإعداد حل الهضم dispase.
تأكد من أن مسحوق dispase هو حل كامل قبل الاحماء الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 5٪ FBS المعطلة للحرارة إلى DMEM لإعداد حل إيقاف. لإعداد المخزن المؤقت Tyrode الأول ، إضافة papain وL - السيستين إلى العازلة التيرود HEPES دون الكالسيوم.
لإعداد العازلة التيرود الثاني، إضافة لوبيتين إلى العازلة HEPES تيرود دون الكالسيوم بتركيز اثنين من microliters لكل ملليلتر. لإعداد المخزن المؤقت FACS، استخدم محلول الملح المتوازن من هانك بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والأحمر الفينول المكمل مع اثنين من ملليمولار EDTA و 2٪ FBS. بعد القتل الرحيم الماوس، واستخدام 21 الإبر قياس لإصلاحه على لوحة جراحية في موقف supine مع الأطراف العليا والسفلية الموسعة.
رش الفراء مع الإيثانول 70٪ لتعقيم المنطقة. باستخدام ملقط مستقيم، ورفع الجلد والفراء من البطن واستخدام مقص تشريح لجعل شق في المركز. باستخدام المقص، وفصل الجلد من الأنسجة تحت الجلد من البطن إلى المناديلا.
أثناء حمل الأنسجة تحت الجلد مع ملقط، وجعل شق صغير مع مقص في وسط جدار البطن. ثم افتح الصفاق مع شق على شكل حرف V. باستخدام ملقط، نقل بلطف الأمعاء الدقيقة إلى الجانب.
تحديد موقع الشريان الأورطي البطني وفينا كافا وجعل شق مع مقص تشريح للسماح لssanguination سريع. حددي مكان الحجاب الحاجز باستخدام إبرة قياس 18، وجعل فتحة في الحجاب الحاجز فقط تحت القص لتفريغ الرئتين.
باستخدام مقص حاد مدبب مستقيم، وقطع على طول قاعدة الأضلاع لفصل الحجاب الحاجز بعناية من القفص الصدري. استخدام ملقط لرفع الطرف المكشوف من القص وقطع طولي القص من قاعدة القفص الصدري إلى الرقبة. استخدم مقصًا قصيرًا مستقيمًا لإجراء شق عنق الرحم المركزي وفصل فصوصين من الغدة دون الرّامن.
بعد ذلك، استخدم زوج من ملقط عالية الدقة دقيقة نقطة لإزالة بعناية النسيج الضام المحيطة و الصعتر الصعترية الإفراط في carina. تشريح القصبة الهوائية الحرة أولا عن طريق فصل نهاية قريبة على مستوى epiglottis ومن ثم تشريح نهاية النهاية البعيدة على مستوى التشعب من القصبة الهوائية. حدد موقع epiglottis وقطع القصبة الهوائية طوليا من epiglottis إلى كارينا.
للبدء، ضع القصبة الهوائية في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 750 ميكرولترات من محلول الهضم المُندمج المُدفأ مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم إضافة 750 ميكرولترات من DMEM مع 5٪ FBS لوقف التفاعل ووضع الأنبوب على الجليد.
نقل القصبة الهوائية إلى طبق بيتري. قم بتوجيه القصبة الهوائية مع الجانب الظهاري الذي يواجهك. القصبة الهوائية التشريحية طولياً لها شكل شبه أسطواني تحتفظ به الحلقات الكرتيلاجية.
الظهارة على السطح المقعر. باستخدام ملقط مستقيم، ربط منطقة epiglottis من القصبة الهوائية إلى طبق بيتري واستخدام مشرط حجم 22 التخلص من كشط الظهارة قبالة القصبة الهوائية. سوف تنفصل الطبقة الظهارية كرقبة شفافة.
استخدم المشرط لتمرم الظهارة ونقل الطبقة الظهارية إلى أنبوب ملليلتر. شطف طبق بيتري مع 750 ميكرولترات من Tyrode الأول العازلة ونقل هذا إلى أنبوب يحتوي على طبقة الظهارية. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر واحتضان في 37 درجة مئوية على شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
ثم إضافة 750 ميكرولترات من الباردة التيرود الثاني العازلة. دوامة الأنسجة هضم بقوة لمدة 20 إلى 30 ثانية. باستخدام حقنة تعلق على إبرة قياس 18، triturate المتجانس 10 مرات.
بعد هذا، انتقل إلى إبرة قياس 21 و triturate 10 إلى 20 مرة أخرى. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. إضافة المخزن المؤقت FACS الباردة في نسبة حجمية من 30 إلى واحد.
أجهزة الطرد المركزي في 350 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في عازلة FACS الباردة. نقل هذا التعليق إلى 12 في 75 ملليمتر البوليسترين أنبوب.
مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي 350 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل الماوسين و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة FACS. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة المضادة للماوس CD1632 لمنع الربط غير المحدد واحتضان الجليد لمدة 15 دقيقة.
ثم إضافة الأجسام المضادة في عناصر التحكم isotype المعنية كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة في حين محمية من الضوء المباشر. بعد هذا، إضافة 4.5 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS الباردة ومزيج.
أجهزة الطرد المركزي في 350 مرة ز و4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 300 microliters من عازلة FACS الباردة. إضافة يوديد البروديوم مباشرة قبل تدفق الفرز السيتومتري.
في هذه الدراسة، يتم عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من ChAT eGFP أستيل أستيل الفلورسنت الفئران مراسل بنجاح لتسلسل الحمض النووي الريبي. يتم تحديد الخلايا من الحطام بزاوية التشتت الأمامية والجانبية. يتم استبعاد Doublets باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي والعرض وارتفاع التشتت الجانبي والعرض.
تكون المضاعفة هي الخلايا التي تحتوي على قيم ذات عرض عالي. داخل الخلايا الفردية، يتم تعريف الخلايا الحية على أنها السكان التي هي الأيودينيوم البروديويد السلبية. ضمن الخلايا المفردة الحية، يتم تحديد الخلايا المنخفضة إلى السالبة CD45 استناداً إلى عنصر تحكم isotype.
ضمن الخلايا السلبية المنخفضة CD45، تكون الخلايا الإيجابية EPCAM التي هي أيضاً eGFP موجبة في قناة FITC مجموعة خلايا الفرشاة. يتم تغيير أرقام الخلايا الفرشاة من خلال التعرض لمستقلبات الميكروبية والبروتوزوا، وبالتالي تعكس تباين الميكروبات المؤسسية. لذلك، فإننا نقترح تقدير عدد خلايا الفرشاة عن طريق المجهر الفلوريس لقياس العدد المتوقع من خلايا الفرشاة المعزولة عن طريق فرز تدفق السيتوميترية.
تأكد من فصل الطبقة الظهارية من القصبة الهوائية بشكل صحيح لأنها تحدد غلة خلايا الفرشاة المعزولة. يمكن استخدام خلايا الفرشاة القصبية المعزولة في مجموعة واسعة من المقايسات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، واستزراع الخلايا والتحليل الوظيفي.
