Nous avons développé une procédure pour l’isolement des cellules trachéales de brosse, des cellules épithéliales chimiosensoryes spécialisées rares des souris fluorescentes d’acétyltransferase de choline. Cette méthode est basée sur une séparation initiale de l’épithélium trachéal de la submucosa permettant une incubation plus courte suivante de la feuille épithéliale avec la papaïne. Ceci permet la récupération robuste des cellules trachéales de brosse et a été avec succès employé pour l’isolement et l’analyse transcriptionnelle des cellules de brosse par séquençage d’ARN.
Une longue incubation avec des enzymes digestives peut diminuer la viabilité cellulaire et modifier le profil transcriptionnel des cellules isolées des tissus. Ici, nous séparons l’épithélium trachéal avec le dispase et l’incuber par la suite avec de la papaïne pendant une courte période de temps produisant des rendements élevés de cellules de brosse viables. Notre méthode peut contribuer aux études de l’épithélium supérieur des voies respiratoires.
Le même protocole peut être appliqué à isoler les cellules de brosse d’autres sites muqueux tels que les tissus nasaux. La démonstration de notre technique hautement reproductible permettra aux pairs scientifiques d’isoler et d’étudier plus en détail les cellules des broussailles trachées. Pour commencer cette procédure, ajouter dispase et DNase I à PBS aux concentrations finales montrées ici pour préparer la solution de digestion dispase.
Assurez-vous que la poudre de dispase est complètement dissoute avant de réchauffer la solution dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 5 % de FBS inactivé par la chaleur au DMEM pour préparer une solution d’arrêt. Pour préparer le tampon Tyrode I, ajouter la papaïne et la L-cystéine à la mémoire tampon de HEPES Tyrode sans calcium.
Pour préparer le tampon Tyrode II, ajouter la leupeptine au tampon de HEPES Tyrode sans calcium à une concentration de deux microlitres par millilitre. Pour préparer le tampon FACS, utilisez la solution de sel équilibré de Hank sans calcium, magnésium et phénol rouge complété par deux millimolaires EDTA et 2%FBS. Après avoir euthanasié la souris, utilisez des aiguilles de calibre 21 pour la fixer sur une planche chirurgicale en position supine avec des extrémités supérieures et inférieures étendues.
Vaporiser la fourrure de 70 % d’éthanol pour assainir la région. À l’aide de forceps droits, soulevez la peau et la fourrure de l’abdomen et utilisez des ciseaux disséquants pour faire une incision au centre. À l’aide des ciseaux, séparer la peau du tissu sous-cutané de l’abdomen à la mandibula.
Tout en tenant le tissu sous-cutané avec les forceps, faire une petite incision avec les ciseaux au centre de la paroi abdominale. Ensuite, ouvrez le péritoine avec une incision en forme de V. À l’aide des forceps, déplacez doucement l’intestin grêle sur le côté.
Localiser l’aorte abdominale et le véna cava et faire une incision avec les ciseaux disséquants pour permettre une exsanguination rapide. Localiser le diaphragme. À l’aide d’une aiguille de calibre 18, faire une ouverture dans le diaphragme juste en dessous du sternum pour dégonfler les poumons.
À l’aide de ciseaux pointus et pointus disséquants, couper le long de la base des côtes pour séparer soigneusement le diaphragme de la cage thoracique. Utilisez les forceps pour soulever l’extrémité exposée du sternum et couper le sternum longitudilement de la base de la cage thoracique au cou. Utilisez de courts ciseaux droits pour faire une incision cervicale centrale et séparer les deux lobes de la glande submandibulaire.
Après cela, utilisez une paire de forceps de haute précision point fin pour enlever soigneusement le tissu conjonctif environnant et le thymus au-dessus de la carina. Disséquer la trachée libre en séparant d’abord l’extrémité proximale au niveau de l’épiglotte, puis en disséquant l’extrémité distale au niveau de la bifurcation de la trachée. Localiser l’épiglotte et couper la trachée longituditinement de l’épiglotte à la carina.
Pour commencer, placez la trachée dans un tube de 1,5 millilitre contenant 750 microlitres de solution de digestion dispase préchauffé à 37 degrés Celsius. Couvrir le tube de papier d’aluminium pour réduire l’exposition à la lumière directe et incuber sur un shaker à 200 RPM et à température ambiante pendant 40 minutes. Ajouter ensuite 750 microlitres de DMEM avec 5% de FBS pour arrêter la réaction et placer le tube sur la glace.
Transférer la trachée dans une boîte de Pétri. Orientez la trachée avec le côté épithélial face vers le haut. La trachée longitudicieusement disséquée a une forme semi-cylindrique maintenue par les anneaux cartilagineux.
L’épithélium est sur la surface concave. À l’aide de forceps droits, attachez la zone épiglotte de la trachée à la boîte de Pétri et utilisez un scalpel d’élimination de taille 22 pour gratter l’épithélium de la trachée. La couche épithéliale se séparera sous forme de feuille translucide.
Utilisez le scalpel pour émincer l’épithélium et transférer la couche épithéliale dans un tube de deux millilitres. Rincez la boîte de Pétri avec 750 microlitres de tampon Tyrode I et transférez-la dans le tube contenant la couche épithéliale. Couvrir le tube de papier d’aluminium pour réduire l’exposition à la lumière directe et incuber à 37 degrés Celsius sur un shaker à 200 RPM pendant 30 minutes.
Ajouter ensuite 750 microlitres de tampon tyrode II froid. Vortex le tissu digéré vigoureusement pendant 20 à 30 secondes. À l’aide d’une seringue fixée à une aiguille de calibre 18, triturer l’homogénéité 10 fois.
Après cela, passer à une aiguille de calibre 21 et triturer 10 à 20 fois de plus. Filtrer les cellules à travers une passoire de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter le tampon FACS froid à un rapport volumétrique de 30 pour un.
Centrifugeuse à 350 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans le tampon FACS froid. Transférer cette suspension dans un tube de polystyrène de 12 par 75 millimètres.
Centrifugeuse à nouveau à 350 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 100 microlitres de tampon FACS. Ensuite, ajoutez un microlitre d’anticorps anti-souris CD1632 bloquant pour bloquer la liaison non spécifique et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
Ajoutez ensuite des anticorps dans les contrôles d’isotype respectifs tels que décrits dans le protocole de texte. Incuber sur la glace pendant 45 minutes tout en étant protégé de la lumière directe. Après cela, ajouter 4,5 millilitres de tampon FACS froid et mélanger.
Centrifugeuse à 350 fois g et à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 300 microlitres de tampon FACS froid. Ajouter l’iodure de propidium immédiatement avant le tri cytométrique d’écoulement.
Dans cette étude, les cellules trachéales de brosse de ChAT eGFP souris fluorescentes de reporter d’acétylcholine sont avec succès isolées pour le séquençage d’ARN. Les cellules sont identifiées à partir de débris par angle de dispersion avant et latéral. Les doublets sont exclus en utilisant la hauteur et la largeur de dispersion avant et la hauteur et la largeur latérales de dispersion.
Les doublets sont les cellules qui ont des valeurs de largeur élevées. Dans les cellules individuelles, les cellules vivantes sont identifiées comme la population qui est propidium iodure négatif. Dans les cellules individuelles vivantes, les cellules faibles à négatives CD45 sont identifiées en fonction du contrôle de l’isotype.
Dans les cellules à faible négatif CD45, les cellules positives EpCAM qui sont également positives eGFP dans le canal FITC sont la population de cellules de brosse. Les nombres de cellules de broussailles sont modifiés par l’exposition aux métabolites microbiens et aux protozoaires et reflètent donc la variabilité du microbiote institutionnel. Par conséquent, nous suggérons d’estimer le nombre de cellules de brosse par microscopie de fluorescence pour évaluer le nombre prévu de cellules isolées de brosse par le tri cytométrique d’écoulement.
Assurez-vous de bien séparer la couche épithéliale de la trachée car elle détermine les rendements des cellules de brosse isolées. Les cellules isolées de brosse trachéale peuvent être employées dans un large éventail d’analyses telles que le séquençage d’ARN, la culture cellulaire et l’analyse fonctionnelle.
