우리는 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 형광 기자 마우스에서 기관 브러시 세포, 희귀 전문 화학 감각 상피 세포의 격리를위한 절차를 개발했다. 이 방법은 아막코사로부터 의 기관 상피의 초기 분리를 기반으로 하여 파통과 함께 상피 시트의 후속 짧은 잠복이 허용된다. 이를 통해 기관 브러시 세포의 강력한 회복을 가능하게 하며 RNA 시퀀싱에 의한 브러시 세포의 격리 및 전사 분석에 성공적으로 사용되었습니다.
소화 효소를 가진 긴 잠복은 세포 생존력을 감소시키고 조직에서 고립된 세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있습니다. 여기서 우리는 디스파스로 기관 상피를 분리하고 그 후 실행 가능한 브러시 세포의 높은 수율을 생산하는 짧은 시간 동안 papain로 배양합니다. 우리의 방법은 상부 기도 상피의 연구에 기여할 수 있습니다.
동일한 프로토콜은 비강 조직과 같은 다른 점막 부위에서 브러시 세포를 격리하는 데 적용될 수 있다. 우리의 매우 재현 가능한 기술의 데모는 동료 과학자가 기관 브러시 세포를 격리하고 더 조사할 수 있게 합니다. 이 절차를 시작하려면 디스파스 소화 용액을 준비하기 위해 여기에 표시된 최종 농도에서 PBS에 디스파스 및 DNase I를 추가하십시오.
섭씨 37도에서 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 다음으로 DMEM에 5%의 열 비활성화 FBS를 추가하여 정지 솔루션을 준비합니다. 티로데 1완충을 준비하려면 칼슘 없이 HEPES 티로데의 완충에 패아픔과 L-시스테인을 넣으세요.
티로데II 버퍼를 준비하려면 밀리리터당 2마이크로리터의 농도로 칼슘 없이 HEPES 티로데의 버퍼에 루페틴을 넣으세요. FACS 버퍼를 준비하려면 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없이 행크의 균형 잡힌 소금 용액을 2밀리머 EDTA와 2%FBS로 보충합니다. 마우스를 안락사한 후, 21 게이지 바늘을 사용하여 상하 사지가 확장된 척추 위치의 수술 판에 고정하십시오.
70%에탄올로 모피를 스프레이하여 이 지역을 살균합니다. 직선 집게를 사용하여 복부의 피부와 털을 들어 올리고 해부 가위를 사용하여 중앙에 절개를 합니다. 가위를 사용하여, 맨디불라에 복부에서 피하 조직에서 피부를 분리합니다.
피하 조직을 집게로 들고 있는 동안 복벽 중앙에 가위를 작은 절개를 합니다. 그런 다음 V자 절개를 한 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 옆으로 부드럽게 이동합니다.
복부 대오르타와 베나 카바를 찾아 급속한 퇴출을 허용하기 위해 해부 가위와 절개를합니다. 다이어프램을 찾습니다. 18 게이지 바늘을 사용하여 흉골 바로 아래에 있는 다이어프램에서 개구부를 만들어 폐를 수축시합니다.
날카로운 뾰족한 직선 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 베이스를 따라 잘라 흉곽에서 다이어프램을 조심스럽게 분리합니다. 집게를 사용하여 흉골의 노출된 끝을 들어 올리고 흉골을 흉곽 의 기지에서 목으로 세로로 자른다. 짧은 직선 가위를 사용하여 중앙 자궁 경부 절개를 하고 복종선의 두 엽을 분리하십시오.
그 후, 미세 한 포인트 고정밀 집게를 사용하여 주변 결합 조직과 카리나 위에 있는 흉선을 조심스럽게 제거하십시오. 먼저 후두개증의 수준에서 근위 쪽 끝을 분리한 다음 기관지의 양분의 수준에서 해부함으로써 기관을 무료로 해부한다. 후두를 찾아 간구에서 카리나까지 세로로 기관을 잘라냅니다.
우선, 기관지는 섭씨 37도까지 예열된 디스파스 소화용액 750마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 200 RPM의 셰이커와 실온에서 40 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 5%의 FBS로 DMEM의 750 마이크로리터를 추가하여 반응을 멈추고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
기관을 페트리 요리로 옮는다. 상피 측이 위를 향하여 기관체를 방향을 지정합니다. 세로적으로 해부된 기관체는 간질 고리에 의해 유지되는 반 원통형 모양을 가지고 있습니다.
상피는 오목한 표면에 있습니다. 직선 집게를 사용하여, 페트리 접시에 기관의 epiglottis 영역을 밧줄과 기관 떨어져 상피를 긁어 크기 22 처리 메스를 사용합니다. 상피 층은 반투명 시트로 분리됩니다.
메스를 사용하여 상피를 다진 후 상피 층을 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 페트리 접시에 750 마이크로리터의 타이로데 1편을 버퍼링하고 상피층을 포함하는 튜브로 옮기다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 30 분 동안 200 RPM에서 셰이커에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.
그런 다음 콜드 티로드 II 버퍼 750 마이크로리터를 추가합니다. 소화된 조직을 20~30초 동안 힘차게 소용돌이시다. 18 게이지 바늘에 부착 된 주사기를 사용하여, 호모게이지네이트를 10 번 삼중화.
이 후, 21 게이지 바늘로 전환하고 10 ~ 20 더 세리세게. 100 마이크로미터 여과기를 통해 50 밀리리터 원내 튜브로 세포를 필터링합니다. 30대 1의 체적 비율로 콜드 FACS 버퍼를 추가합니다.
원심분리기는 350배, 섭씨 4도에서 10분간. 상체를 버리고 차가운 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이 서스펜션을 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 옮기십시오.
원심분리기는 다시 350배, 섭씨 4도에서 10분간 다시 원심분리기를 사용한다. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 다음으로, 항체를 차단하는 항마우스 CD1632의 마이크로리터 를 추가하여 비특이적 결합을 차단하고 15분 동안 얼음에 배양합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각각의 등류형 컨트롤에 항체를 추가합니다. 직접 조명으로부터 보호하면서 45분 동안 얼음에 배양합니다. 그 후, 차가운 FACS 버퍼의 4.5 밀리리터를 추가하고 혼합합니다.
원심분리기는 350배, 섭씨 4도. 상체를 버리고 300 마이크로리터의 콜드 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 유동 세포 계수 정렬 직전에 프로피듐 요오드를 추가합니다.
이 연구에서는, ChAT eGFP 아세틸콜린 형광 기자 마우스로부터의 기관 브러시 세포는 RNA 시퀀싱을 위해 성공적으로 분리된다. 세포는 전방 및 측면 산란 각도로 이물질에서 식별됩니다. 더블은 전방 산란 높이와 너비 및 측면 산란 높이 및 너비를 사용하여 제외됩니다.
두 배는 너비 값이 높은 셀입니다. 단일 세포 내에서, 살아있는 세포는 프로디듐 요오드 음성인 집단으로 확인된다. 살아있는 단일 세포 내에서, CD45는 상류형 대조군을 기반으로 낮은 음수 세포로 확인된다.
CD45 낮은 음수 세포 내에서 FITC 채널에서 eGFP 양성인 EpCAM 양성 세포는 브러시 셀의 집단이다. 브러쉬 세포 수는 미생물 대사 산물과 원생동물에 노출에 의해 변경되고 그러므로 기관 microbiota의 가변성을 반영합니다. 따라서, 우리는 유동 세포 분류에 의해 고립 된 브러시 세포의 예상 수를 측정하기 위해 형광 현미경 검사법에 의해 브러시 세포의 수를 추정하는 것이 좋습니다.
격리된 브러시 셀의 수율을 결정할 때 기관지의 상피 층을 올바르게 분리해야 합니다. 상기 분리된 기관 브러시 세포는 RNA 염기서열 분석, 세포 배양 및 기능분석과 같은 광범위한 분석에서 사용될 수 있다.
