Desenvolvemos um procedimento para o isolamento de células de escova traqueal, raras células epiteliais especializadas de quimosenso de camundongos repórteres fluorescentes de acetiltransferase de colina. Este método baseia-se em uma separação inicial do epitélio traqueal da submucosa permitindo uma posterior incubação mais curta da folha epitelial com papain. Isso permite uma recuperação robusta das células de escova traqueal e tem sido usado com sucesso para isolamento e análise transcricional de células escovas por sequenciamento de RNA.
A longa incubação com enzimas digestivas pode diminuir a viabilidade celular e alterar o perfil transcricional das células isoladas dos tecidos. Aqui separamos o epitélio traqueal com dispase e, posteriormente, incubamos-no com papain por um curto período de tempo produzindo altos rendimentos de células de escova viáveis. Nosso método pode contribuir para estudos de epitélio das vias aéreas superiores.
O mesmo protocolo pode ser aplicado ao isolamento de células escovas de outros locais mucosas, como tecido nasal. A demonstração de nossa técnica altamente reprodutível permitirá que os cientistas se isolarem e investiguem ainda mais as células de escova traqueal. Para iniciar este procedimento, adicione dispase e DNase I à PBS nas concentrações finais mostradas aqui para preparar a solução de digestão de despase.
Certifique-se de que o pó despase esteja totalmente dissolvido antes de aquecer a solução em um banho de água a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione FBS inativados a calor de 5% ao DMEM para preparar uma solução de parada. Para preparar o tampão Tyrode I, adicione papain e L-cisteína ao tampão hepes tyrode sem cálcio.
Para preparar o tampão Tyrode II, adicione leupeptina ao tampão hepes tyrode sem cálcio em uma concentração de dois microliters por mililitro. Para preparar o tampão FACS, use a Solução de Sal Balanceado da Hank sem cálcio, magnésio e vermelho fenol suplementado com dois EDTA milimil e 2% FBS. Após eutanásia do mouse, use agulhas de calibre 21 para fixá-lo em uma placa cirúrgica na posição supina com extremidades superiores e inferiores estendidas.
Pulverize a pele com 70% de etanol para higienizar a área. Usando fórceps retos, levante a pele e a pele do abdômen e use uma tesoura dissecando para fazer uma incisão no centro. Usando a tesoura, separe a pele do tecido subcutâneo do abdômen para a mandibula.
Enquanto segura o tecido subcutâneo com os fórceps, faça uma pequena incisão com a tesoura no centro da parede abdominal. Em seguida, abra o peritônio com uma incisão em forma de V. Usando os fórceps, mova suavemente o intestino delgado para o lado.
Localize a aorta abdominal e a veia cava e faça uma incisão com a tesoura dissecando para permitir a exsanguinação rápida. Localize o diafragma. Usando uma agulha calibre 18, faça uma abertura no diafragma logo abaixo do esterno para esvaziar os pulmões.
Usando uma tesoura de dissecação reto afiada, corte ao longo da base das costelas para separar cuidadosamente o diafragma da caixa torácica. Use os fórceps para levantar a extremidade exposta do esterno e cortar o esterno longitudinalmente da base da caixa torácica até o pescoço. Use uma tesoura reta curta para fazer uma incisão cervical central e separe os dois lóbulos da glândula submandibular.
Depois disso, use um par de fórceps de alta precisão de ponta fina para remover cuidadosamente o tecido conjuntivo circundante e o timo sobrelying a carina. Disseque a traqueia livre separando primeiro a extremidade proximal ao nível da epiglote e, em seguida, dissecando a extremidade distal ao nível da bifurcação da traqueia. Localize a epiglote e corte a traqueia longitudinalmente das epiglotes até a carina.
Para começar, coloque a traqueia em um tubo de 1,5 mililitro contendo 750 microliters de solução de digestão despase pré-aquecida a 37 graus Celsius. Cubra o tubo com papel alumínio para reduzir a exposição à luz direta e incubar em um agitador a 200 RPM e à temperatura ambiente por 40 minutos. Em seguida, adicione 750 microliters de DMEM com 5% de FBS para parar a reação e colocar o tubo no gelo.
Transfira a traqueia para uma placa de Petri. Oriente a traqueia com o lado epitelial virado para cima. A traqueia disseca dissecada longitudinalmente tem uma forma semi-cilíndrica mantida pelos anéis cartilaginosos.
O epitélio está na superfície côncava. Usando fórceps retos, amarre a área de epiglote da traqueia à placa de Petri e use um bisturi de descarte tamanho 22 para raspar o epitélio da traqueia. A camada epitelial se separará como uma folha translúcida.
Use o bisturi para picar o epitélio e transfira a camada epitelial para um tubo de dois mililitros. Enxágüe a placa de Petri com 750 microliters de tampão Tyrode I e transfira isso para o tubo contendo a camada epitelial. Cubra o tubo com papel alumínio para reduzir a exposição à luz direta e incubar a 37 graus Celsius em um agitador a 200 RPM por 30 minutos.
Em seguida, adicione 750 microliters de tampão Tyrode II frio. Vórtice o tecido digerido vigorosamente por 20 a 30 segundos. Usando uma seringa presa a uma agulha calibre 18, triturar a homogeneizar 10 vezes.
Depois disso, mude para uma agulha de calibre 21 e triturar mais 10 a 20 vezes. Filtre as células através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione o tampão FACS frio a uma proporção volumosa de 30 para um.
Centrifugar a 350 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em tampão FACS frio. Transfira esta suspensão para um tubo de poliestireno de 12 por 75 milímetros.
Centrifugar novamente a 350 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 100 microliters de tampão FACS. Em seguida, adicione um microliter de anticorpos de bloqueio CD1632 anti-rato para bloquear a ligação não específica e incubar no gelo por 15 minutos.
Em seguida, adicione anticorpos nos respectivos controles isótipos, conforme descrito no protocolo de texto. Incubar no gelo por 45 minutos enquanto estiver protegido contra luz direta. Depois disso, adicione 4,5 mililitros de tampão FACS frio e misture.
Centrifugar a 350 vezes g e a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 300 microliters de tampão FACS frio. Adicione iodeto de propidium imediatamente antes da classificação citométrica de fluxo.
Neste estudo, as células de escova traqueal de camundongos repórteres fluorescentes de acetilcolina ChAT eGFP são isoladas com sucesso para sequenciamento de RNA. As células são identificadas a partir de detritos por ângulo de dispersão para a frente e lateral. Os doublets são excluídos usando altura e largura de dispersão dianteira e altura e largura de dispersão lateral.
Os doublets são as células que têm altos valores de largura. Dentro das células únicas, as células vivas são identificadas como a população que é propidium iodecida negativo. Dentro das células individuais vivas, as células CD45 de baixa a negativa são identificadas com base no controle do isótipo.
Dentro das células negativas cd45 baixas, as células positivas EpCAM que também são eGFP positivas no canal FITC são a população de células escovas. Os números de células escovas são alterados pela exposição a metabólitos microbianos e protozoários e, portanto, refletem a variabilidade da microbiota institucional. Portanto, sugerimos estimar o número de células escovas por microscopia de fluorescência para medir o número esperado de células de escova isoladas por classificação citométrica de fluxo.
Certifique-se de separar adequadamente a camada epitelial da traqueia, pois determina os rendimentos de células isoladas da escova. As células de escova traqueal isoladas podem ser usadas em uma ampla gama de ensaios como sequenciamento de RNA, cultura celular e análise funcional.
