Desarrollamos un procedimiento para el aislamiento de células de cepillo traqueal, raras células epiteliales quimiosensoriales especializadas de ratones reportero fluorescentes de acetiltransferasa de colina. Este método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa permitiendo una posterior incubación más corta de la hoja epitelial con papaína. Esto permite una recuperación robusta de las células del cepillo traqueal y se ha utilizado con éxito para el aislamiento y el análisis transcripcional de las células del cepillo mediante la secuenciación del ARN.
La incubación prolongada con enzimas digestivas puede disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células aisladas de los tejidos. Aquí separamos el epitelio traqueal con dispase y posteriormente lo incubamos con papaína durante un corto período de tiempo produciendo altos rendimientos de células de cepillo viables. Nuestro método puede contribuir a estudios del epitelio de las vías respiratorias superiores.
El mismo protocolo se puede aplicar a aislar las células del cepillo de otros sitios de la mucosa, como el tejido nasal. La demostración de nuestra técnica altamente reproducible permitirá a los científicos de pares aislar e investigar más a fondo las células del cepillo traqueal. Para comenzar este procedimiento, agregue disase y DNase I a PBS a las concentraciones finales mostradas aquí para preparar la solución de digestión dispase.
Asegúrese de que el polvo dispase esté completamente disuelto antes de calentar la solución en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, agregue un 5% de FBS inactivado por calor a DMEM para preparar una solución de detención. Para preparar el tampón Tyrode I, agregue papaína y L-cisteína al tampón de HEPES Tyrode sin calcio.
Para preparar el tampón Tyrode II, añada leupeptina al tampón de HEPES Tyrode sin calcio a una concentración de dos microlitros por mililitro. Para preparar el tampón FACS, utilice la solución de sal equilibrada de Hank sin calcio, magnesio y rojo fenol complementado con dos EDTA mililares y 2%FBS. Después de eutanasiar el ratón, utilice agujas de calibre 21 para fijarlo en una placa quirúrgica en la posición supina con extremidades superiores e inferiores extendidas.
Rocíe el pelaje con 70% de etanol para desinfectar el área. Usando fórceps rectos, levante la piel y el pelaje del abdomen y use tijeras diseccionentas para hacer una incisión en el centro. Usando las tijeras, separe la piel del tejido subcutáneo del abdomen a la mandibula.
Mientras sostiene el tejido subcutáneo con los fórceps, haga una pequeña incisión con las tijeras en el centro de la pared abdominal. A continuación, abra el peritoneo con una incisión en forma de V. Usando los fórceps, mueva suavemente el intestino delgado hacia un lado.
Localiza la aorta abdominal y la vena cava y haz una incisión con las tijeras diseccionantes para permitir una rápida exsanguinación. Localice el diafragma. Usando una aguja de calibre 18, haz una abertura en el diafragma justo debajo del esternón para desinflar los pulmones.
Usando tijeras de disección rectas puntiagudas afiladas, corte a lo largo de la base de las costillas para separar cuidadosamente el diafragma de la caja torácica. Utilice los fórceps para levantar el extremo expuesto del esternón y cortar el esternón longitudinalmente desde la base de la caja torácica hasta el cuello. Utilice tijeras rectas cortas para hacer una incisión cervical central y separar los dos lóbulos de la glándula submandibular.
Después de esto, utilice un par de fórceps de alta precisión de punto fino para eliminar cuidadosamente el tejido conectivo circundante y el timo que cubre la carina. Diseccionar la tráquea libre separando primero el extremo proximal a nivel de la epiglotis y luego diseccionando el extremo distal a nivel de la bifurcación de la tráquea. Localice la epiglotis y corte la tráquea longitudinalmente de la epiglotis a la carina.
Para comenzar, coloque la tráquea en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 750 microlitros de solución de digestión dispasa precalentada a 37 grados centígrados. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa e incubar en una coctelera a 200 RPM y a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, agregue 750 microlitros de DMEM con 5%FBS para detener la reacción y colocar el tubo sobre hielo.
Transfiera la tráquea a un plato de Petri. Orientar la tráquea con el lado epitelial hacia arriba. La tráquea diseccionada longitudinalmente tiene una forma semicilíndrica mantenida por los anillos cartilaginosos.
El epitelio está en la superficie cóncava. Usando fórceps rectos, ata el área de epiglotis de la tráquea al plato Petri y usa un bisturí de desecho de tamaño 22 para raspar el epitelio de la tráquea. La capa epitelial se separará como una hoja translúcida.
Usa el bisturí para picar el epitelio y transfiere la capa epitelial a un tubo de dos mililitros. Enjuague el plato Petri con 750 microlitros de Tyrode I buffer y transfieralo al tubo que contiene la capa epitelial. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa e incubar a 37 grados Centígrados en una coctelera a 200 RPM durante 30 minutos.
A continuación, agregue 750 microlitros de tyrode II tampón frío. Vórtice el tejido digerido vigorosamente durante 20 a 30 segundos. Usando una jeringa unida a una aguja de calibre 18, triturar el homogeneato 10 veces.
Después de esto, cambie a una aguja de calibre 21 y triturar de 10 a 20 veces más. Filtrar las células a través de un colador de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue el búfer FACS frío a una relación volumétrica de 30 a uno.
Centrifugar a 350 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en tampón FACS frío. Transfiera esta suspensión a un tubo de poliestireno de 12 por 75 milímetros.
Centrifugar de nuevo a 350 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpos de bloqueo de CD1632 antiratón para bloquear la unión no específica e incubar en hielo durante 15 minutos.
A continuación, agregue anticuerpos en los controles de isotipo respectivos como se describe en el protocolo de texto. Incubar sobre hielo durante 45 minutos mientras está protegido de la luz directa. Después de esto, agregue 4,5 mililitros de tampón FACS frío y mezcle.
Centrífuga a 350 g y a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 microlitros de tampón FACS frío. Añadir yoduro de propidio inmediatamente antes de la clasificación citométrica de flujo.
En este estudio, las células de cepillo traqueal de chAT eGFP ratones reportero fluorescentes de acetilcolina se aíslan con éxito para la secuenciación de ARN. Las células se identifican a partir de escombros por ángulo de dispersión hacia adelante y hacia un lado. Las dobles se excluyen utilizando la altura y la anchura de dispersión hacia delante y la altura y anchura de dispersión lateral.
Los dobletes son las celdas que tienen valores de ancho altos. Dentro de las células individuales, las células vivas se identifican como la población que es negativo de yoduro propidium. Dentro de las células individuales vivas, las células bajas a negativas CD45 se identifican en función del control de isotipo.
Dentro de las células negativas bajas CD45, las células positivas de EpCAM que también son positivas de eGFP en el canal FITC son la población de células de cepillo. Los números celulares del cepillo se alteran por la exposición a metabolitos microbianos y protozoos y, por lo tanto, reflejan la variabilidad de la microbiota institucional. Por lo tanto, sugerimos estimar el número de células de cepillo por microscopía de fluorescencia para medir el número esperado de células aisladas del cepillo por clasificación citométrica de flujo.
Asegúrese de separar correctamente la capa epitelial de la tráquea a medida que determina los rendimientos de las células aisladas del cepillo. Las células aisladas del cepillo traqueal se pueden utilizar en una amplia gama de ensayos como la secuenciación de ARN, el cultivo celular y el análisis funcional.
