Biz trakeal fırça hücrelerinin izolasyon u için bir prosedür geliştirdi, kolin asetiltransferaz floresan muhabir farelerden nadir özel kemosensory epitel hücreleri. Bu yöntem, trakeal epitelin submukozadan ilk olarak ayrılmasına dayanır ve epitel tabakasının papain ile daha kısa sürede inkübasasına olanak sağlar. Bu, trakeal fırça hücrelerinin sağlam bir şekilde kurtarılmasını sağlar ve Fırça hücrelerinin RNA dizilimi ile izolasyon ve transkripsiyonel analizi için başarıyla kullanılmıştır.
Sindirim enzimleri ile uzun kuluçka hücre canlılığını azaltabilir ve dokulardan izole hücrelerin transkripsiyonprofilini değiştirebilir. Burada trakeal epiteli dispase ile ayırıyoruz ve daha sonra kısa bir süre için papain ile kuluçkaya yatıyoruz ve uygun fırça hücrelerinin yüksek verimi elde ediyoruz. Yöntemimiz üst hava yolu epitel çalışmalarına katkıda bulunabilir.
Aynı protokol, burun dokusu gibi diğer mukozal bölgelerden fırça hücrelerinin izole edilmesi için de uygulanabilir. Son derece tekrarlanabilir tekniğimizin gösterilmesi, akran bilim adamlarının trakeal fırça hücrelerini izole edip daha fazla araştırmalarına olanak sağlayacaktır. Bu prosedüre başlamak için, dispase sindirim çözeltisini hazırlamak için burada gösterilen son konsantrasyonlarda PBS'ye dispase ve DNase I ekleyin.
Dispase tozu tamamen 37 santigrat derece bir su banyosunda çözelti ısınmadan önce çözülmüş olduğundan emin olun. Ardından, durdurma çözümü hazırlamak için DMEM'e %5 ısı yla inaktive EDILMIŞ FBS ekleyin. Tyrode I tampon hazırlamak için, kalsiyum olmadan HEPES Tyrode tampon papain ve L-sistein ekleyin.
Tyrode II tampon hazırlamak için, mililitre başına iki mikrolitre konsantrasyonunda kalsiyum olmadan HEPES Tyrode tampon löpeptin ekleyin. FACS tampon hazırlamak için, kalsiyum olmadan Hank Dengeli Tuz Çözeltisi kullanın, magnezyum ve fenol kırmızı iki milimolar EDTA ve% 2 FBS ile takviye. Fare ötenazi sonra, genişletilmiş üst ve alt ekstremiteler ile supine pozisyonda bir cerrahi tahta üzerinde düzeltmek için 21 gauge iğneler kullanın.
Bölgeyi dezenfekte etmek için kürkü %70 etanolle püskürtün. Düz forseps kullanarak, karın deri ve kürk kaldırın ve merkezinde bir kesi yapmak için kesme makas kullanın. Makas kullanarak, mandibula karın deri altı dokudan cilt ayırın.
Forceps ile deri altı doku tutarken, karın duvarının merkezinde makas ile küçük bir kesi yapmak. Sonra V şeklinde bir kesi ile periton açın. Forceps kullanarak, yavaşça yan ince bağırsak hareket ettirin.
Abdominal aort ve vena kava sını bulun ve hızlı eksanguiasyon alabilmek için diseksiyon makası ile bir kesi yapın. Diyaframı bul. 18 gauge iğne kullanarak, akciğerleri söndürmek için göğüs hemen altında diyafram bir açıklık yapmak.
Keskin sivri düz diseksiyon makası kullanarak, dikkatle göğüs kafesi diyafram ayırmak için kaburga tabanı boyunca kesilmiş. Sternumun açıktaki ucunu kaldırmak için forsepsleri kullanın ve göğüs kafesinin tabanından boynuna kadar göğüs kafesini uzunlamasına kesin. Merkezi bir servikal kesi yapmak ve submandibular bezin iki lobları ayırmak için kısa düz makas kullanın.
Bundan sonra, dikkatle çevreleyen bağ dokusu ve karina örten timus kaldırmak için ince nokta yüksek hassasiyetli forceps bir çift kullanın. Önce proksimal ucunu epiglottis seviyesinde ayırarak ve daha sonra trakeanın çatallanma düzeyinde distal ucunu keserek trakeayı serbest çesitsiz olarak ayırın. Epiglottis'i bulun ve epiglottan karinaya kadar trakeayı uzunlamasına kesin.
Başlamak için, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış dispase sindirim çözeltisi 750 mikrolitre içeren 1.5 mililitrelik bir tüp içine trakea yerleştirin. 200 RPM'de ve 40 dakika oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda doğrudan ışığa ve kuluçkaya maruz kalmamayı azaltmak için tüpü alüminyum folyo ile kapatın. Daha sonra reaksiyonu durdurmak ve tüpü buza yerleştirmek için %5 FBS ile 750 mikrolitre DMEM ekleyin.
Nefes borusunu Petri kabına aktar. Nefes borusunu epitel tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Uzunlamasına olarak incelenmiş trakea, kıkırdak halkalar tarafından korunan yarı silindirik bir şekle sahiptir.
Epitel içbükey yüzeyde. Düz forceps kullanarak, Petri kabına trakea epiglottis alanı tether ve trakea epitel kazımak için bir boyut 22 bertaraf neşter kullanın. Epitel tabakası yarı saydam bir tabaka olarak ayrılır.
Epitel kıyma ve iki mililitrelik tüp epitel tabakası aktarmak için neşter kullanın. Petri kabını 750 mikrolitre Tyrode I tamponuyla durulayın ve bunu epitel tabakasını içeren tüpe aktarın. 30 dakika boyunca 200 RPM bir shaker üzerinde 37 santigrat derece doğrudan ışığa ve kuluçka yada maruz kalma azaltmak için alüminyum folyo ile tüp kapağı.
Sonra soğuk Tyrode II tampon 750 mikrolitre ekleyin. Girdap 20-30 saniye boyunca şiddetle sindirilmiş doku. 18 kalibrelik bir iğneye bağlı bir şırınga kullanarak homojeni 10 kez triturate edin.
Bundan sonra, 21 gauge iğne ye geçin ve 10 ila 20 kez daha triturate. Hücreleri 100 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. 30'a bir hacimsel oranda soğuk FACS tampon ekleyin.
Santrifüj 350 kez g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede. Supernatant atın ve soğuk FACS tampon pelet resuspend. Bu süspansiyonu 12'ye 75 milimetrelik polistiren tüpe aktarın.
Santrifüj tekrar 350 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat. Supernatant atın ve FACS tampon 100 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatmak için bir mikrolitre anti-fare CD1632 bloke edici antikor ekleyin.
Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi ilgili isotip kontrollerine antikor ekleyin. Doğrudan ışıktan korunurken 45 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Bundan sonra, soğuk FACS tampon 4,5 mililitre ekleyin ve karıştırın.
Santrifüj 350 kez g ve dört santigrat derecede. Supernatant atın ve soğuk FACS tampon 300 mikrolitre pelet resuspend. Akış sitometrik sıralama hemen önce propidium iyodür ekleyin.
Bu çalışmada, ChAT eGFP eGFP asetilkolin floresan muhabiri farelerin trakeal fırça hücreleri başarıyla RNA dizileme için izole edilmiştir. Hücreler enkazdan ileri ve yan dağılım açısıile tanımlanır. Doublets ileri dağılım yüksekliği ve genişliği ve yan dağılım yüksekliği ve genişliği kullanılarak dışlanır.
Doublets yüksek genişlik değerlerine sahip hücrelerdir. Tek hücreler içinde, canlı hücreler propidium iyodür negatif popülasyon olarak tanımlanır. Canlı tek hücrelerde, CD45 düşük negatif hücreler iyotip kontrolüne göre tanımlanır.
CD45 düşük negatif hücreler içinde, FITC kanalında da eGFP pozitif olan EpCAM pozitif hücreler fırça hücrelerinin popülasyonudur. Fırça hücre numaraları mikrobiyal metabolitlere ve protozoamaruz bırakılarak değiştirilir ve bu nedenle kurumsal mikrobiyotanın değişkenliğini yansıtır. Bu nedenle, akış sitometrik sıralama ile izole fırça hücrelerinin beklenen sayısını ölçmek için floresan mikroskobu ile fırça hücrelerinin sayısını tahmin öneririz.
İzole edilmiş fırça hücrelerinin verimini belirlerken trakeanın epitel tabakasını düzgün bir şekilde ayırdığından emin olun. İzole trakeal fırça hücreleri RNA sıralama, hücre kültürü ve fonksiyonel analiz gibi tahliller geniş bir dizi kullanılabilir.
