في هذا الفيديو، نقدم دليلًا خطوة بخطوة لجمع الخفافيش بطريقة إنسانية، تهدف إلى تقليل التأثير على السكان وتعظيم القيمة العلمية. مزايا نهجنا هي أن نزيد من كمية البيانات الجزيئية والمورفولوجية المحتملة لكل خفاش ، والحفاظ على الأنسجة للحفاظ على قيمتها المستقبلية ، وتقليل حصاد الأفراد البرية. بروتوكولات تشريح يصعب إثبات لفظيا.
العديد من تقنيات إعداد الأنسجة التي نقدمها هنا يتم توصيلها بشكل أفضل من خلال تصور كيفية تحديد الأعضاء المختلفة ، ومن ثم تشريحها وتخزينها بشكل صحيح. إعداد جميع قوارير قبل البدء في أي تشريح لتجنب التأخير. بالنسبة للرنا، خصص عدد القنينات اللازمة لكل عينة.
تسمية كل أنبوب مع نوع الأنسجة التي سيتم جمعها، فضلا عن معلومات تحديد العينة القياسية. ملء قوارير 50٪ كامل من حمض الريبا حل الاستقرار، والبرد إلى أربع درجات مئوية. الحرص على عدم ملء قوارير تماما مع حمض نووي الريبي استقرار الحل, كما قد تنفجر أنبوب عند وضعه في النيتروجين السائل.
مباشرة بعد القتل الرحيم، قم بقطع رأس عينة الخفافيش كما هو موضح في بروتوكول النص. جلد الجمجمة من الشعر، اللفافة، وعضلات الجمجمة، بما في ذلك الجلد على الأنف. الحرص على عدم كسر الواجهة الأمامية للأنف.
إزالة العينين مع ملقط، وذلك باستخدام قوة قوية بما فيه الكفاية لفصل العصب البصري. ضع العينين في قارورة مليلتر من محلول استقرار الحمض النووي الريبي. استخدم المقص لإجراء قطع القوس على الجزء الظهري من الجمجمة بدءًا من الرقبة ، مع الحرص على عدم تلف الدماغ.
ثم، استخدام ملقط لسحب بلطف كلا الجانبين من الجمجمة، حتى تصدع مفتوحة لفضح الدماغ. تأكد من إزالة جمجمة نهاية الجمجمة، بحيث يمكن أن تتخلص من ملقط بسهولة الدماغ. كشط الدماغ بلطف مع ملقط.
الدماغ سيكون ناعم جداً سوف تصبح لمبة حاسة الشم مرئية، ويجلس في الجزء البطني من الجزء الداخلي من الجمجمة. حاول أن تبقي المصباح الشمي ملتصقاً
إذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على شكل الدماغ سليمة، ووضعها على الفور على الجليد الجاف، أو في قارورة خمسة ملليلتر من حمض نوويRNA استقرار الحل. على نهاية السد من الجمجمة، وينبغي أن cochlei الآن مرئية بشكل جانبي على كل جانب من الرأس. استخدام ملقط لسحب بلطف cochlei.
ثم، وضعها في قارورة ملليلتر واحد من حمض نوويRNA استقرار الحل. جعل اثنين من الشقوق حيث العلوي والسفلي الفك الانضمام، وإزالة الفك السفلي. سوف تصبح لوحة cribriform واضحة.
هذا هو العظام الحرجة للحفاظ على الباحث الموجهة. ويمكن تحديدها على أنها المنطقة الأكثر الأمامي من الجمجمة، مع عدة رواه، ومع اثنين من الأخاقد حيث المصباح الشمي تقع. وبمجرد إزالة الفك السفلي، أزل المنصة من الجزء المتبقي من الجمجمة.
تأكد من أن الفك يحتوي على لوحة cribriform. وضع الأنف في حمض نوويRNA استقرار الحل، وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. من الفك السفلي، وقطع اللسان مع مقص، ومكان في قارورة ملليلتر من حمض نوويRNA استقرار الحل.
وضع قارورة الأنف في النيتروجين السائل بعد نقع بين عشية وضحاها في حمض الريبا حل الاستقرار. بعد 24 ساعة من القع على الجليد، أو في الثلاجة، ضع العينات في النيتروجين السائل. استخدام مشرط لاختراق من خلال تجويف البطن، مما يجعل شق طولي يصل إلى الأضلاع.
هذا يفقد الإطار الهيكلي. تعري الجلد للكشف عن العضلات الصدرية، وأخذ عينتين على الأقل من العضلات. يتم جمع الأنسجة لكل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي خلال هذه التشريحات.
مكان الأنسجة للوزن الجزيئي العالي الحمض النووي في اكريفالات جافة، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. مكان الأنسجة للرنا في حمض الريبا حل الاستقرار. قطع من خلال القص، وسحب بعيدا الأضلاع.
الآن، إسترجاع الرئة والقلب. استخدم المشرط والملباب لفصل القلب عن الرئة. استخدام مشرط لتفريق الرئة، ووضع في حمض نوويRNA استقرار الحل.
جمع القلب، والتي يمكن أن تؤخذ كاملة، ولكن ينبغي أن تكون مقسمة إلى أنصاف، بحيث يتمقع حل استقرار الجيش الملكي النيبالي تماما. الآن، أخذ عينات من الكبد. خذ على الأقل عينتين من الكبد.
ضع عينة واحدة في قارورة لتبقى مجمدة للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي ، ووضع العينة الأخرى في محلول استقرار الحمض النووي الريبي. اتبع القناة الكبدية للعثور على البنكرياس والمرارة. نقل المرارة إلى قارورة من حمض الريبا حل الاستقرار.
العثور على المعدة، والطحال مثل الريش في قاعدة انها، التي تظهر كظل مختلف من الأرجواني. يجب أن يكون البنكرياس أيضا مرئية هنا كبنية الوزن. جمع المعدة والطحال والبنكرياس، في قارورة كل من الحمض النووي الريبي استقرار الحل.
جمع عينات صغيرة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة. مكان في قارورة كل من حمض الرنا حل الاستقرار. تأخذ واحدة من الكلى، واتبع قنواتها إلى المثانة، ثم وضع في قارورة كل منهما من حمض الريبا حل الاستقرار.
استخدم الكلى الأخرى كدليل للعثور على الخصيتين إذا كان ذكراً، أو رحماً ومبيضاً إذا كانت أنثى. جمع واحد أو كل من الهناد إذا كان ذلك ممكنا. أيضا أخذ عينات من أجزاء مختلفة من الجلد من الجناح، والاحتفاظ بها في قارورة منفصلة.
الميزة الرئيسية لنهجنا هو أنه يسمح لنا لأخذ عينات الحيوانات بطريقة غير قاتلة، في حين لا تزال تولد ما يكفي من المواد لدراسات الجينوم، فضلا عن الدراسات الجزيئية الوظيفية. بروتوكولنا يسمح بإعداد الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجناح. وتمثل هذه الخلايا مصدراً ثميناً متجدداً للمواد الوراثية، فضلاً عن نموذج للاستكشافات الوظيفية والجزيئية في الخفافيش.
يجب نقل مقاطع الجناح التي تم الاحتفاظ بها في وسائط النمو حسب القسم السادس من البروتوكول المكتوب إلى مرفق زراعة الأنسجة. نقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر. يستخدم غشاء الجناح خزعة لهذا العرض.
إزالة بعناية متوسطة النمو. غسل بلطف الخزعة مرتين مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. إضافة 500 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر الكولاجين أربعة إلى الأنبوب.
وهذا سوف يسبب هضم الأنسجة في الخلايا الفردية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون تحريض. في اليوم الثاني، جعل متوسط النمو الجديد، وقبل الدفء إلى 37 درجة مئوية.
إعداد ستة بئر لوحة الأنسجة عن طريق إضافة ملليلترين من الطازجة قبل الدفء المتوسطة النمو في كل بئر من لوحة لاستخدامها. تخزين هذه اللوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى الحاجة. إزالة أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على الخلايا من الحاضنة، وإخماد رد فعل الهضم عن طريق إضافة ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج.
Resuspend الخلايا عن طريق triturating بعناية الحل مع طرف P1000 ماصة لتحقيق تعليق خلية واحدة. تدور بلطف أسفل الخلايا في جهاز طرد مركزي الطاولة لمدة ثلاث دقائق في 300 مرة G.Discard المابير عن طريق إزالة بلطف 80 إلى 90٪ من السائل مع ماصة P1000. Resuspend بيليه في 500 microliters من متوسطة النمو مسبقا.
قم بتكوير التعليق بلطف لضمان أن البيليه لم يعد مرئيًا ، وأن الخلايا معلقة بما فيه الكفاية ، مع التأكد من تجنب قطع صغيرة من الأنسجة التي قد تكون لا تزال مرئية على الجدران. بلطف ماصة كامل حجم تعليق الخلية في بئر واحد من لوحة الآبار الستة التي تم إعدادها في وقت سابق، تحتوي على وسائل الإعلام النمو قبل الدفء. صخرة بلطف لوحة من جانب إلى آخر ومن الأمام إلى الوراء مرتين إلى ثلاث مرات لمساعدة الخلايا على توزيع على سطح البئر في طبقة واحدة.
تحقق من الخلايا المطلية تحت المجهر. يجب أن تكون خلايا واحدة تظهر مُتَمَرّحة و عائمة، لكن كثيفة جداً. ضع اللوحة بعناية في حاضنة مسبقة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد حوالي 24 ساعة، لاحظ الخلايا تحت المجهر لتحديد صحة الثقافة. الخلايا يجب أن تكون الآن تعلق على سطح لوحة، وتظهر بالارض. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مرطبة مسبقا إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
وينبغي أن تكون لاحظت الخلايا تحت المجهر بانتظام لتحديد الحاجة إلى المرطبات وسائل الإعلام أو تقسيم. كلما لزم الأمر، بعناية تعرق ما يقرب من 50٪ من المتوسط من البئر، وإضافة بلطف ملليلتر واحد من متوسطة النمو مسبقا إلى جانب البئر، حتى لا يزعج الخلايا. عندما يكون من الضروري تمرير الخلايا، بعناية التعرق تقريبا 90٪ من متوسطة النمو.
غسل الخلايا بلطف شديد عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى جدار البئر، حتى لا يزعج الخلايا. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا والجانب إلى الجانب مرتين إلى ثلاث مرات. pirate بعناية كل من برنامج تلفزيوني من لوحة قبل غسل الخلايا مرة أخرى.
إضافة التربسين EDTA إلى البئر، وروك بلطف لوحة لتغطية سطح كامل من البئر مع التربسين EDTA، واحتضان لمدة دقيقة ونصف في درجة حرارة الغرفة. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازجة مسبقا. الماصات صعودا وهبوطا ما يقرب من خمس مرات لغسل الخلايا من سطح لوحة، وضمان الخلايا في التعليق.
ضع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر، وتدور أسفل الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدة لمدة ثلاث دقائق في 300 مرة G.Discard المابير عن طريق إزالة بلطف 80 إلى 90 في المئة من السائل مع ماصة P1000. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من متوسطة النمو مسبقا، و triturate بلطف تعليق. تأكد من أن بيليه أو شظايا كبيرة من بيليه لم تعد مرئية، والخلايا في تعليق خلية واحدة.
لحساب الخلية باستخدام عداد خلية الآلي، مزيج من 10 ميكرولتر aliquot من الخلايا المعلقة واحد إلى واحد مع الأزرق trypan للكشف عن الخلايا القابلة للحياة. احتضان لمدة دقيقة واحدة، والماصات 10 ميكرولترات من الحل على الشريحة العد. أدخل شريحة العد في عداد خلية تلقائي لحساب الخلايا باستخدام الإعدادات المناسبة.
إعداد وسائل الإعلام تجميد من خلال الجمع بين متوسط النمو مع DMSO للحصول على تركيز نهائي من 10٪ DMSO. وينبغي إعداد بيليه من 80 إلى 90٪ التقاء جيدا من ستة بئر لوحة. resuspend بيليه في ملليلتر ونصف من تجميد المتوسطة.
ضع حوالي 750 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل من cryتين المنفصلتين. ضع القنينات في حاوية تجميد التبريد، بحيث تتجمد الخلايا ببطء للحفاظ على حيوية الخلية. ضعهم على الفور عند 80 درجة مئوية ناقص.
لإذابة الخلايا المجمدة، وإعداد لوحة ستة بئر تحتوي على مليلترين من متوسط النمو مسبقا في كل بئر التي سيتم استخدامها. الحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى الحاجة. خذ قارورة واحدة من الخلايا من النيتروجين السائل، ووضعها في حمام الماء الدافئ لذوبان الخلايا بسرعة.
هذا يجب أن يستغرق دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بمجرد أن يذوب المحلّل في القارورة، فإنّ الماصات بلطف ترتفع وتُنْصَل لتجانس المحلّل، وعلى الفور وضع المحلّل بأكمله في بئر واحد من الـ6 صحن بئر. صخرة بلطف لوحة من جانب إلى آخر ومن الأمام إلى الوراء مرتين إلى ثلاث مرات لمساعدة الخلايا على توزيع على سطح البئر في طبقة واحدة.
وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. مراقبة مرور الخلايا كما هو موضح. وتظهر النتائج التمثيلية لاستخراج الحمض النووي لتحليل الحمض النووي القياسية من ثلاثة أنواع الخفافيش.
يشير نطاق واحد كبير إلى حد أدنى من التجزؤ، وأجزاء مماثلة الحجم من الحمض النووي من كل استخراج لكل منها. مؤشر مشترك لنجاح استخراج الحمض النووي الريبي هو عدد RNA سلامة، أو RIN، مع القيم فوق ثمانية تمثل جودة عالية في رنا اللباقة. تظهر هنا قيم RIN لاستخراج الحمض النووي الريبي من 13 نوعًا مختلفًا من أنواع الخفافيش النيوروبية ، تم أخذ عينات منها في أربع مناطق مختلفة.
تم وضع الأنسجة التي تم أخذ عينات منها من الأنواع في أنديس، كوستاريكا، وجمهورية الدومينيكان مباشرة في النيتروجين السائل بعد نقع في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم وضع الأنسجة التي تم أخذ عينات منها من الأنواع في منطقة الأمازون في النيتروجين السائل بعد أسبوع تقريبًا من وضع محلول استقرار الحمض النووي الريبي ، والاحتفاظ بها عند أربع درجات مئوية بشكل مستمر. وحتى في مثل هذه الحالات، كانت قيم RIN مماثلة لتلك التي وضعت على الفور في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي، ومباشرة في النيتروجين السائل.
بعد زراعة الأنسجة، يجب أن تغطي الثقافات خلية الخفافيش 80 إلى 90٪ من سطح لوحة، والحفاظ على مورفولوجيا الأصلي. وهذا يمثل المرحلة المثلى لتقسيم. بعد أكثر من ستة مقاطع، سوف الخلايا تغيير مورفولوجيا لتصبح أكبر وأطول، والخلايا ستدخل senescence.
الخلايا الزاهية الكرة حتى تمثل الخلايا الميتة. تمثل الخلايا في الثقافة مصدرًا متجددًا للمواد ، مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. ويمكن تجميد هذه الخطوط الخلوية، مما يوفر موردا يمكن استخدامه على مدى سنوات عديدة من البحث.
وهذا يسمح الدراسات الجينومية، النسخية، والوظيفية التي سوف تكون صعبة باستخدام الأنسجة الأولية. على سبيل المثال، يمكن تعديل الخلايا وراثيا أو كيميائيا لمراقبة الآثار على الأنماط الظاهرية الخلوية.
