В этом видео, мы предоставляем шаг за шагом руководство по сбору летучих мышей в гуманным образом, предназначенных для минимизации воздействия на население и максимизировать научную ценность. Преимущества нашего подхода в том, что мы максимизируем количество потенциальных молекулярных и морфологических данных для каждой летучей мыши, сохраняем ткани, чтобы сохранить их будущую ценность, и минимизируем сбор диких особей. Протоколы вскрытия трудно устно продемонстрировать.
Многие из методов подготовки тканей мы представляем здесь лучше всего общаться через визуализацию, как различные органы определены, а затем должным образом вскрыты и хранятся. Подготовь все флаконы перед началом вскрытия, чтобы избежать задержек. Для РНК отложите в сторону количество флаконов, необходимых для каждого образца.
Наклеить этикетку каждой трубки с типом ткани, которые будут собраны, а также стандартной идентификационной информации образца. Заполните флаконы 50%полный РНК стабилизирующий раствор, и охладить до четырех градусов по Цельсию. Позаботьтесь, чтобы не заполнить флаконы полностью с РНК стабилизирующий раствор, как трубка может взорваться при размещении его в жидком азоте.
Сразу же после эвтаназии выполните обезглавливание образца летучей мыши, как описано в текстовом протоколе. Кожа черепа из волос, фасции и мышц черепа, в том числе кожи на носу. Позаботьтесь, чтобы не сломать переднюю часть носа.
Удалите глаза типсами, используя достаточно сильную силу, чтобы отделить зрительный нерв. Поместите глаза в двухми миллилитровый флакон стабилизирующего раствора РНК. Используйте ножницы, чтобы сделать sagittal вырезать на спинной части черепа, начиная с шеи, заботясь, чтобы не повредить мозг.
Затем используйте щипец, чтобы аккуратно оттянуть обе стороны черепа, пока он не будет взломан, чтобы разоблачить мозг. Убедитесь, что череп черепа был удален, так что типсы могут легко соскребать мозг. Аккуратно соскребать мозг типсами.
Мозг будет очень мягким. Обонятельная лампочка станет видимой, сидя на брюшной части внутренней части черепа. Старайтесь держать обонятельную лампу прилагается.
Если это возможно, сохранить форму мозга нетронутыми, и сразу же поместить его на сухой лед, или в пять миллилитров флакон РНК стабилизирующий раствор. На хвостовом конце черепа, кохлеи теперь должны быть боково видны с каждой стороны головы. Используйте типсы, чтобы аккуратно вытащить кохлеи.
Затем положите их в один двухми миллилитровый флакон стабилизирующего раствора РНК. Сделайте два разреза, где верхняя и нижняя челюсть соединяются, и удалите нижнюю челюсть. Крибриформная пластина станет очевидной.
Это критическая кость, чтобы держать исследователь ориентированы. Его можно определить как наиболее переднюю область черепа, с несколькими передними, и с двумя канавками, где обонятельная луковица лежит. После удаления челюсти снимите трибуну с оставшейся части черепа.
Убедитесь, что челюсть включает в себя крибриформную пластину. Поместите нос в РНК стабилизирующий раствор, и хранить при четырех градусах по Цельсию на ночь. Из нижней нижней нижней челюсти, вырезать язык ножницами, и поместите в два миллилитров флакона РНК стабилизирующий раствор.
Поместите нос флакон в жидкий азот после ночного замочить в РНК стабилизирующий раствор. После 24 часов замачивания на льду, или в холодильнике, поместите образцы в жидкий азот. Используйте скальпель, чтобы пробить брюшную полость, делая продольный разрез до ребер.
Это лишает скелетную раму. Стрип кожи выявить грудной мышцы, и взять по крайней мере два образца мышц. Ткани для РНК и ДНК собираются во время этих вскрытий.
Поместите ткани для высокой молекулярной массы ДНК в сухие криовиалы, и вспышки замерзают в жидком азоте. Поместите ткани для РНК в раствор стабилизации РНК. Прорежьте грудину и оттяните ребра.
Теперь, получить легких и сердца. Используйте скальпель и миппы, чтобы отделить сердце от легких. Используйте скальпель, чтобы разбить легкое, и поместите в РНК стабилизирующий раствор.
Соберите сердце, которое можно взять целым, но следует разрезать на половинки, чтобы раствор РНК стабилизировался тщательно впитывается. Теперь возьмите образцы из печени. Возьмите по крайней мере два образца печени.
Поместите один образец во флакон, чтобы остаться замороженным для ДНК с высоким молекулярным весом, и поместите другой образец в стабилизирующий раствор РНК. Следуйте печеночным протоком, чтобы найти поджелудочной железы и желчного пузыря. Перенесите желчный пузырь на флакон стабилизирующего раствора РНК.
Найти желудок, и перо, как селезенка на его базе, появляясь как другой оттенок фиолетового. Поджелудочная железа также должна быть видна здесь как структура веса. Соберите желудок, селезенку и поджелудочную железу, в соответствующих флаконах рнк стабилизирующий раствор.
Соберите небольшие образцы тонкой и толстой кишки. Поместите в соответствующие флаконы стабилизирующего раствора РНК. Возьмите одну из почек, и следуйте их протоки в мочевой пузырь, а затем поместить в соответствующие флаконы РНК стабилизирующий раствор.
Используйте другую почку в качестве руководства, чтобы найти яички, если мужчины, или матки и яичников, если женщина. Соберите один или оба гонада, если это возможно. Также возьмите образцы различных частей кожи крыла, и держите в отдельных флаконах.
Основным преимуществом нашего подхода является то, что он позволяет нам отведать животных нелетальным способом, при этом генерируя достаточно материала для геномных исследований, а также функциональных молекулярных исследований. Наш протокол позволяет готовить первичные фибробласты из ткани крыла. Клетки представляют собой драгоценный возобновляемый источник генетического материала, а также модель функциональных и молекулярных исследований летучих мышей.
Крыло клипы, которые были сохранены в средствах массовой информации роста в соответствии с разделом шесть письменного протокола должны быть переданы в ткани культуры объекта. Перенесите содержимое трубки в 15-миллилитровую коническую центрифугу. Для этой демонстрации используется биопсия мембраны крыла.
Аккуратно удалите среду роста. Аккуратно промыть биопсию два раза с помощью 500 микролитров стерильных PBS. Добавьте в трубку 500 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр коллагеназы четыре.
Это приведет к перевариванию ткани в отдельных клетках. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию без возбуждения. На второй день, сделать свежий рост среды, и довести его до 37 градусов по Цельсию.
Подготовьте шесть пластин культуры хорошо ткани, добавив два миллилитров свежей довоенной среды роста в каждом колодец пластины, которые будут использоваться. Храните эту пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор до необходимости. Удалите 15 миллилитровую трубку, содержащую клетки из инкубатора, и утолите реакцию пищеварения, добавив один миллилитр свежей среды роста.
Resuspend клетки путем тщательно triturating разрешение с наконечником пипетки P1000 для того чтобы достигнуть одной подвески клетки. Аккуратно вращайте клетки в центрифуге столешницы в течение трех минут при 300 раз G.Discard супернатант, аккуратно удаляя от 80 до 90% жидкости с P1000 пипеткой. Повторное производство гранул в 500 микролитров довоенной среды роста.
Аккуратно тритурировать подвеску, чтобы гарантировать, что гранулы больше не видны, и что клетки достаточно приостановлено, убедившись, чтобы избежать небольших кусочков ткани, которые все еще могут быть видны на стенах. Аккуратно пипетка весь объем клеточной подвески в один колодец из шести пластины хорошо, который был подготовлен ранее, содержащий довоенный рост средств массовой информации. Аккуратно качайте пластину из стороны в сторону и спереди назад два-три раза, чтобы помочь клеткам распределить по поверхности хорошо в одном слое.
Проверьте потроханые клетки под микроскопом. Они должны быть одиночными клетками, которые появляются с мячом и плавающие, но очень плотные. Аккуратно поместите пластину в инкубатор, заданный до 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Примерно через 24 часа наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы определить здоровье культуры. Клетки теперь должны быть прикреплены к поверхности пластины, и появляются сплющенные. Поддерживайте клетки во влажном инкубаторе до 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Клетки должны наблюдаться под микроскопом регулярно, чтобы определить необходимость обновления средств массовой информации или расщепления. Всякий раз, когда это необходимо, тщательно аспирировать примерно 50% среды из хорошо, и осторожно добавить один миллилитр предварительной среды роста в сторону хорошо, чтобы не беспокоить клетки. Когда необходимо пройти клетки, тщательно аспирировать примерно 90% среды роста.
Вымойте клетки очень осторожно, добавив один миллилитр стерильных PBS к стене колодец, чтобы не беспокоить клетки. Аккуратно качайте пластину вперед и назад и из стороны в сторону два-три раза. Тщательно аспирировать все PBS от пластины перед мытьем клеток снова.
Добавить трипсин ЭДТА в колодец, и осторожно рок пластины, чтобы покрыть всю поверхность хорошо с трипсином EDTA, и инкубировать в течение полутора минут при комнатной температуре. Утолить реакцию, добавив один миллилитр свежей довоенной среды роста. Pipette вверх и вниз примерно пять раз, чтобы вымыть клетки с поверхности пластины, и обеспечить клетки находятся в подвеске.
Поместите подвеску клетки в 15 миллилитровую трубку и вращайте клетки в центрифуге столешницы в течение трех минут при 300 раз G.Discard супернатант, аккуратно удаляя от 80 до 90 процентов жидкости с P1000 пипеткой. Resuspend гранулы в один миллилитр довоенной среды роста, и осторожно тритурировать подвеску. Убедитесь, что гранулы или большие фрагменты гранул больше не видны, и клетки находятся в одной клеточной подвеске.
Чтобы подсчитать ячейку с помощью автоматизированного счетчика ячейки, смешайте десять микролитер-алицитов подвесных ячеек один к одному с трипан-синим цветом для обнаружения жизнеспособных клеток. Инкубировать в течение одной минуты, и пипетку 10 микролитров раствора на счет слайда. Вставьте слайд подсчета в автоматизированный счетчик ячеек, чтобы подсчитать ячейки, используя соответствующие настройки.
Подготовка замораживания средств массовой информации путем объединения среды роста с DMSO для получения окончательной концентрации 10%DMSO. Гранулы должны быть подготовлены от 80 до 90% стечения хорошо из шести пластины хорошо. Переусейте гранулы в полтора миллилитров замораживания среды.
Поместите около 750 микролитров клеточной подвески в каждый из двух отдельных криовилов. Поместите флаконы в криогенный замораживающий контейнер, чтобы клетки медленно замерзали, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток. Немедленно поместите их при минус 80 градусах по Цельсию.
Чтобы разморозить замороженные клетки, приготовьте шесть пластинок, содержащих два миллилитра довоенной среды роста в каждой хорошо, которая будет использоваться. Поддерживайте пластину в инкубаторе 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа до необходимости. Возьмите один флакон клеток из жидкого азота, и поместите его в теплую водяную ванну, чтобы быстро разморозить клетки.
Это должно занять от двух до трех минут. Как только раствор во флаконе разморозится, аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы гомогенизировать раствор, и сразу же поместить весь раствор в один колодец из шести хорошо пластины. Аккуратно качайте пластину из стороны в сторону и спереди назад два-три раза, чтобы помочь клеткам распределить по поверхности хорошо в одном слое.
Поместите клетки в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и пятипроцентный углекислый газ в течение 24-48 часов. Мониторинг и прохождение ячеек, как попродемонстрировано. Репрезентативные результаты извлечения ДНК показаны для стандартного анализа ДНК трех видов летучих мышей.
Одна большая полоса указывает на минимальную фрагментацию и аналогичные фрагменты ДНК из каждой соответствующей экстракции. Распространенным показателем успеха для извлечения РНК является число целостности РНК, или RIN, со значениями выше восьми, представляющих высокое качество тактовой РНК. Здесь показаны значения RIN извлечения РНК из 13 различных типов тканей неотропических видов летучих мышей, отобранных в четырех различных населенных пунктах.
Ткани, взятые у видов в Тесе, Коста-Рике и Доминиканской Республике, были помещены непосредственно в жидкий азот после замачивания в растворе РНК при четырех градусах цельсия за одну ночь. Ткани, взятые у видов в Амазонии, были помещены в жидкий азот примерно через неделю после размещения раствора стабилизации РНК и непрерывно удерживались на уровне четырех градусов по Цельсию. Даже в таких случаях значения РИН были сопоставимы с значениями, непосредственно помещенными в стабилизирующий раствор РНК и непосредственно в жидкий азот.
Следуя культуре тканей, культуры летучих мышей должны покрывать от 80 до 90% поверхности пластины и поддерживать их первоначальную морфологию. Это является оптимальным этапом для расщепления. После более чем шести проходов, клетки изменят свою морфологию, чтобы стать больше и длиннее, и клетки войдут в сенесценцию.
Яркие скоеяные клетки представляют собой мертвые клетки. Клетки в культуре представляют собой возобновляемый источник материала, как ДНК, РНК и белок. Эти клеточные линии могут быть заморожены, обеспечивая тем самым ресурс, который может быть использован в течение многих лет исследований.
Это позволяет геномных, транскриптомных и функциональных исследований, которые будут сложными с использованием первичных тканей. Например, клетки могут быть модифицированы генетически или химически для наблюдения за воздействием на клеточные фенотипы.
