Neste vídeo, fornecemos um guia passo a passo para coletar morcegos de forma humana, com o objetivo de minimizar o impacto sobre as populações e maximizar o valor científico. As vantagens de nossa abordagem são que maximizamos a quantidade de dados moleculares e morfológicos potenciais para cada morcego, preservamos tecidos para reter seu valor futuro e minimizamos a colheita de indivíduos selvagens. Os protocolos de dissecção são difíceis de demonstrar verbalmente.
Muitas das técnicas de preparação tecidual que apresentamos aqui são melhor comunicadas através da visualização de como diferentes órgãos são identificados e, em seguida, devidamente dissecados e armazenados. Prepare todos os frascos antes de iniciar qualquer dissecção para evitar atrasos. Para o RNA, reserve o número de frascos necessários para cada espécime.
Rotule cada tubo com o tipo de tecido que será coletado, bem como informações padrão de identificação da amostra. Encha os frascos 50% cheios de solução estabilizadora de RNA e esfrie até quatro graus celsius. Tome cuidado para não encher os frascos completamente com a solução estabilizadora do RNA, pois o tubo pode explodir ao colocá-lo em nitrogênio líquido.
Imediatamente após a eutanásia, realize a decapitação do espécime do morcego, conforme descrito no protocolo de texto. Esfoe o crânio dos músculos do cabelo, fáscia e crânio, incluindo a pele no nariz. Tome cuidado para não quebrar a parte da frente do nariz.
Remova os olhos com fórceps, usando força forte o suficiente para desprender o nervo óptico. Coloque os olhos em um frasco de dois mililitros de solução estabilizadora de RNA. Use uma tesoura para fazer um corte sagital na porção dorsal do crânio começando pelo pescoço, tomando cuidado para não danificar o cérebro.
Em seguida, use fórceps para puxar suavemente para trás ambos os lados do crânio, até que ele é rachado aberto para expor o cérebro. Certifique-se de que o crânio da extremidade craniana foi removido, para que fórceps possam facilmente raspar o cérebro. Raspe suavemente o cérebro com fórceps.
O cérebro será muito macio. A lâmpada olfativa ficará visível, sentada na parte ventral do interior do crânio. Tente manter a lâmpada olfativa presa.
Se possível, mantenha a forma cerebral intacta, e coloque-a imediatamente em gelo seco, ou em um frasco de cinco mililitros de solução estabilizadora de RNA. Na extremidade caudal do crânio, o cochlei deve agora ser lateralmente visível em cada lado da cabeça. Use fórceps para puxar suavemente o cochlei.
Em seguida, coloque-os em um frasco de dois mililitros de solução estabilizadora RNA. Faça duas incisões onde a mandíbula superior e inferior se juntam, e remova a mandíbula. A placa cribriforme se tornará aparente.
Este é um osso crítico para manter o pesquisador orientado. Pode ser identificada como a região mais anterior do crânio, com múltiplos forames, e com duas ranhuras onde a lâmpada olfativa repousa. Uma vez que a mandíbula tenha sido removida, remova o rostrum da parte restante do crânio.
Certifique-se de que a mandíbula inclui a placa cribriforme. Coloque o nariz na solução estabilizadora do RNA e armazene a quatro graus celsius durante a noite. Da mandíbula inferior, corte a língua com uma tesoura, e coloque em um frasco de dois mililitros de solução estabilizadora de RNA.
Coloque o frasco do nariz em nitrogênio líquido seguindo a solução de estabilização do RNA durante a noite. Depois de 24 horas de imersão no gelo, ou na geladeira, coloque as amostras em nitrogênio líquido. Use um bisturi para perfurar a cavidade abdominal, fazendo uma incisão longitudinal até as costelas.
Isso perde o quadro esquelético. Retire a pele para revelar o músculo peitoral, e pegue pelo menos duas amostras de músculo. Tecidos para RNA e DNA são coletados durante essas dissecções.
Coloque tecidos para DNA de alto peso molecular em criovias secas, e congele em nitrogênio líquido. Coloque tecidos para RNA na solução estabilizadora de RNA. Corte o esterno e retire as costelas.
Agora, recupere o pulmão e o coração. Use o bisturi e fórceps para separar o coração do pulmão. Use um bisturi para quebrar o pulmão, e coloque na solução estabilizadora do RNA.
Colete o coração, que pode ser tomado inteiro, mas deve ser seccionado em metades, para que a solução de estabilização do RNA desaque completamente. Agora, pegue amostras do fígado. Pegue pelo menos duas amostras de fígado.
Coloque uma amostra em um frasco para permanecer congelado para DNA de alto peso molecular, e coloque a outra amostra na solução estabilizadora do RNA. Siga o ducto hepático para encontrar o pâncreas e a vesícula biliar. Transfira a vesícula biliar para um frasco de solução estabilizadora de RNA.
Encontre o estômago, e o baço em forma de pena em sua base, aparecendo como um tom diferente de roxo. O pâncreas também deve ser visível aqui como uma estrutura de peso. Recolher o estômago, o baço e o pâncreas, em respectivos frascos de solução estabilizadora de RNA.
Colete pequenas amostras do intestino delgado e grande. Coloque em respectivos frascos da solução estabilizadora RNA. Pegue um dos rins, e siga seus dutos até a bexiga, em seguida, coloque em respectivos frascos de solução estabilizadora de RNA.
Use o outro rim como guia para encontrar os testículos se masculino, ou útero e ovários se feminino. Colete uma ou ambas as gônnas, se possível. Também pegue amostras de várias partes da pele da asa, e mantenha em frascos separados.
A principal vantagem de nossa abordagem é que ela nos permite provar animais de forma não letal, enquanto ainda gera material suficiente para estudos genômicos, bem como estudos moleculares funcionais. Nosso protocolo permite a preparação de fibroblastos primários a partir de tecido de asa. As células representam uma preciosa fonte renovável de material genético, bem como um modelo para explorações funcionais e moleculares em morcegos.
Clipes de asa que foram preservados na mídia de crescimento conforme a seção seis do protocolo escrito devem ser transferidos para a instalação de cultura de tecidos. Transfira o conteúdo do tubo para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros. A biópsia da membrana das asas é usada para esta demonstração.
Remova cuidadosamente o meio de crescimento. Lave suavemente a biópsia duas vezes com 500 microliters de PBS estéril. Adicione 500 microliters de um miligrama por mililitro colagenase quatro ao tubo.
Isso causará a digestão do tecido em células individuais. Incubar durante a noite a 37 graus celsius sem agitação. No segundo dia, faça um novo meio de crescimento, e pré-aquece-o a 37 graus celsius.
Prepare uma placa de cultura de seis poços adicionando dois mililitros de meio de crescimento pré-armado fresco em cada poço da placa a ser usada. Armazene esta placa em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono até que seja necessário. Remova o tubo de 15 mililitros contendo as células da incubadora e sacie a reação de digestão adicionando um mililitro de meio de crescimento fresco.
Resuspenque as células triturando cuidadosamente a solução com uma ponta de pipeta P1000 para obter uma única suspensão celular. Gire suavemente as células em uma centrífuga de mesa por três minutos a 300 vezes G.Descarte o supernaente removendo suavemente 80 a 90% do líquido com uma pipeta P1000. Resuspend a pelota em 500 microliters de meio de crescimento pré-w.
Triturar suavemente a suspensão para garantir que a pelota não esteja mais visível, e que as células estejam suficientemente suspensas, certificando-se de evitar pequenos pedaços de tecido que ainda podem ser visíveis nas paredes. Pipeta suavemente todo o volume de suspensão celular em um único poço da placa de seis poços que foi preparado anteriormente, contendo a mídia de crescimento pré-inquem. Balance suavemente a placa de um lado para o outro e frente para trás duas a três vezes para ajudar as células a distribuir sobre a superfície do poço em uma única camada.
Verifique as células banhadas sob um microscópio. Devem ser células únicas que aparecem com bola para cima e flutuando, mas muito densas. Coloque cuidadosamente a placa em uma incubadora predefinida a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após aproximadamente 24 horas, observe as células sob o microscópio para determinar a saúde da cultura. As células devem agora ser anexadas à superfície da placa, e parecem achatadas. Mantenha as células em uma incubadora umidificada predefinida a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
As células devem ser observadas sob o microscópio regularmente para determinar a necessidade de refresco ou divisão da mídia. Sempre que necessário, aspire cuidadosamente aproximadamente 50% do meio do poço, e adicione suavemente um mililitro de meio de crescimento pré-armado ao lado do poço, para não perturbar as células. Quando necessário passar as células, aspirar cuidadosamente aproximadamente 90% do meio de crescimento.
Lave as células muito suavemente adicionando um mililitro de PBS estéril à parede do poço, para não perturbar as células. Balance suavemente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro duas a três vezes. Aspire cuidadosamente todo o PBS da placa antes de lavar as células novamente.
Adicione trippsina EDTA ao poço, e balance suavemente a placa para cobrir toda a superfície do poço com trippsina EDTA, e incubar por um minuto e meio em temperatura ambiente. Sacie a reação adicionando um mililitro de meio de crescimento pré-armado fresco. Pipeta para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes para lavar as células da superfície da placa, e garantir que as células estejam em suspensão.
Coloque a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e gire as células em uma centrífuga de mesa por três minutos a 300 vezes G.Descarte o supernaente removendo suavemente 80 a 90% do líquido com uma pipeta P1000. Resuspenque a pelota em um mililitro de meio de crescimento pré-armado, e triturar suavemente a suspensão. Certifique-se de que a pelota ou grandes fragmentos da pelota não são mais visíveis, e as células estão em uma única suspensão celular.
Para contar a célula usando um contador celular automatizado, misture uma alíquota de dez microliteres das células suspensas de um a um com azul trypan para detectar células viáveis. Incubar por um minuto, e pipeta 10 microliters da solução no slide de contagem. Insira o slide de contagem em um contador automatizado de células para contar as células usando as configurações apropriadas.
Prepare a mídia de congelamento combinando meio de crescimento com DMSO para obter uma concentração final de 10% DMSO. A pelota deve ser preparada de um poço confluente de 80 a 90% de uma placa de seis poços. Resuspende a pelota em um mililitro e meio de congelamento.
Coloque aproximadamente 750 microliters de suspensão celular em cada um dos dois criovials separados. Coloque os frascos em um recipiente de congelamento criogênico, de modo que as células congelem lentamente para manter a vitalidade celular. Coloque-os imediatamente a menos 80 graus celsius.
Para descongelar as células congeladas, prepare uma placa de seis poços contendo dois mililitros de meio de crescimento pré-armado em cada poço que será usado. Mantenha a placa na incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono até que seja necessário. Pegue um frasco de células de nitrogênio líquido, e coloque-o em um banho de água quente para descongelar rapidamente as células.
Isso deve levar de dois a três minutos. Assim que a solução no frasco tiver descongelado, gentilmente pipeta para cima e para baixo para homogeneizar a solução, e imediatamente colocar toda a solução em um poço da placa de seis poços. Balance suavemente a placa de um lado para o outro e frente para trás duas a três vezes para ajudar as células a distribuir sobre a superfície do poço em uma única camada.
Coloque as células na incubadora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Monitore e escoe as células como demonstrado. Resultados representativos de extrações de DNA são mostrados para análises padrão de DNA de três espécies de morcegos.
Uma única faixa grande indica fragmentação mínima, e fragmentos de tamanho semelhante de DNA de cada respectiva extração. Um indicador comum de sucesso para extrações de RNA é o número de integridade do RNA, ou RIN, com valores acima de oito representando alta qualidade no RNA tato. Aqui são mostrados valores rin de extrações de RNA de 13 tipos diferentes de espécies de morcegos neotropicais, amostrados em quatro localidades diferentes.
Tecidos amostrados de espécies nos Andes, Costa Rica e República Dominicana foram colocados diretamente em nitrogênio líquido após imersão na solução estabilizadora de RNA a quatro graus celsius durante a noite. Os tecidos amostrados de espécies na Amazônia foram colocados em nitrogênio líquido aproximadamente uma semana depois de colocar uma solução estabilizadora de RNA, e mantidos a quatro graus celsius continuamente. Mesmo nesses casos, os valores de RIN eram comparáveis aos imediatamente colocados na solução estabilizadora do RNA, e diretamente em nitrogênio líquido.
Seguindo a cultura tecidual, as culturas das células morcegos devem cobrir 80 a 90% da superfície da placa, e manter sua morfologia original. Isso representa o estágio ideal para a divisão. Após mais de seis passagens, as células mudarão sua morfologia para se tornarem maiores e mais longas, e as células entrarão em senescência.
Células brilhantes em bolas representam células mortas. As células na cultura representam uma fonte renovável de material, como DNA, RNA e proteína. Essas linhas celulares podem ser congeladas, fornecendo assim um recurso que pode ser usado ao longo de muitos anos de pesquisa.
Isso permite estudos genômicos, transcriômicos e funcionais que serão desafiadores usando tecidos primários. Por exemplo, as células podem ser modificadas geneticamente ou quimicamente para observar efeitos nos fenótipos celulares.
