Безопасное и эффективное доставка элементов Cas9 в клетки имеет решающее значение для редактирования генов на основе терапии. Протоколы, которые мы показываем здесь, отображают новый подход в этом направлении. Протокол использует новый метод электропорации, называемый трубчатой электропорации.
Это приводит к высоким показателям выживаемости клеток, а также к скорости редактирования генов. Метод электропорации трубки является вирус, препарат, и репортер обогащения бесплатно. Они являются предпочтительными в клинических приложениях, поэтому с генной терапии на основе редактирования.
Метод универсально применим ко многим типам клеток. Например, человеческие гематопоэтические клетки, первичные Т-клетки и другие клетки могут быть отредактированы с помощью нашего метода. Этот метод электропорации трубки использует тонкую трубку.
Если вы первый раз пользователь, вы можете попробовать GFP выражения плазмидной ДНК. Демонстрация процедуры будет Linyuan Ма, postdoc из моей лаборатории. Для начала этой процедуры приобретут человеческие iPSCs из коллекции американской культуры типа.
Культура iPSCs на искусственной внеклеточной матрицы с фидер-свободной клеточной культуры среды в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в соответствии с инструкциями поставщика. За два часа до трансфекции лечить iPSCs с 10 микромолящих Rho-связанных спиральный катушки, содержащие ингибитор белка киназы Y-27632. При трансфекции диссоциативные iPSCs с клеточным раствором отслоения для одиночных клеток при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Затем подсчитайте количество ячеек. Для того чтобы установить культуру клетки кролика fibroblast получить биопсию кожи уха от кончика уха кролика. Промыть ткань дважды с DPBS содержащие 5%пенициллин-стрептомицин.
Перенесите промытую ушную ткань на новое шестиметровое блюдо культуры тканей и разрежьте ткань на мелкие кусочки, каждый примерно по одному миллиметру. Добавьте несколько капель FBS, чтобы предотвратить высыхание тканей. После этого, распространение измельченных тканей в 10 сантиметров ткани культуры блюдо и добавить 10 миллилитров культуры среды.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5% углекислого газа в течение трех-пяти дней. Через три-пять дней после покрытия используйте трипсин-ЭДТА для переваривания клеток при 37 градусах Цельсия в течение двух минут, а затем подсчитайте количество клеток. После проектирования и синтеза гРНК и донорских олиго, подготовить клетки, как описано ранее.
Повторное воздействие от 20 до 30 000 клеток в 20 микролитров буфера электропорации. Pipette вверх и вниз тщательно производить одну подвеску ячейки. Для cas9 RNP transfection предварительно смешайте два микрограмма белка Cas9 NLS с 0,67 микрограммами гРНК при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
Аккуратно смешайте сформированный комплекс RNP с двумя микрограммами ssODN с клетками. Используя универсальные наконечники пипеток из электропорации комплекта, перенесите клеточную смесь в 20 микролитровую электропорацию трубки. Поместите трубку электропорации в слот электропоратора и нажмите идти, чтобы закончить.
Успешный электропоральный цикл указывается отчетом о пульсе на экране дисплея электропоратора. После электропорации перенесите клетки iPS человека на один миллилитр предварительно разогретого Y-27632, содержащего культурную среду, как описано ранее. Затем пластины resuspended клеток в одном хорошо 12-хорошо пластины клеточной культуры.
Продолжить культивирование пластины, убедившись, что изменить культуру среды каждый день. Y-27632 удаляется из человеческой культуры iPSC среды 24 часов после электропорации. Через 72 часа после электропорации, урожай клеток.
Для клеток фибробластов кролика используйте трипсин-ЭДТА для переваривания клеток из культурной пластины. Для человеческих iPSCs использовать клеточный раствор отряда для переваривания клеток из культуры пластин. Кратко центрифуга образцов на 1000 об / мин в течение пяти минут, и повторного перерасхода клеток с 350 миллилитров лиза буфера.
Инкубировать ночь при 55 градусах по Цельсию. На следующий день извлекайте геномную ДНК с помощью фенол-хлороформа с помощью стандартных процедур. Увеличь от 100 до 200 баз пар фрагментов ДНК из гелей, используя либо гель извлечения комплект или непосредственно из продуктов ПЦР с помощью PCR SV мини-комплект.
Для определения эффективности редактирования генов путем секвенирования бактериальной колонии используйте комплект клонирования TOPO-TA для влечения очищенных продуктов ПЦР в вектор ПЦР4-ТОПО. Случайно подобрать бактериальных клонов и последовательности вставки с помощью универсального секвенирования грунтовки, предоставляемые TOPO-TA клонирования комплекта. Чтобы определить эффективность редактирования генов путем глубокого секвенирования, отправьте ранее полученные очищенные продукты ПЦР для секвенирования CRISPR amplicon в ядро секвенирования ДНК.
В этом исследовании метод электропорации трубки эффективно используется для доставки CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs кроликам и клеткам человека, что приводит к надежному, точному редактированию генов. Во-первых, мутации C231Y и No235X производятся в гене IL2RG, а мутация R150G производится в гене SPR в клетках фибробластов кролика. Конкретные конструкции sgRNA и скорость редактирования генов, определяемые бактериальным клонированием TA, показаны здесь.
Локус IL2RG C231 из 28 секвенирован клонов имеет точную мутацию C231Y, четыре мутации вставки или удаления переноски, а остальные 23 — дикого типа. На локусе IL2RG No235 из 27 секвенирований клонов два имеют точную мутацию q235X, три несут мутацию indel, а остальные — дикого типа. На локусе SPG R150 из 20 секвенирований клонов пять имеют точную мутацию гена R150, 10 перестановок indel carry indel, а остальные — дикого типа.
Электропорация трубки затем используется для доставки Cas9 RNP и ssODNs для человеческих iPSCs и целевых клинически значимых локусов в генах EGFR, Mybpc3 и HBB. В локусе EGFR 15,68% аллелей имеют точные точечные мутации, 22,75% несут indel мутации, а остальные 61,57% являются дикими типами. На локусе Mybpc3 37,92% несут точные четыре базовые пары TGAA удаления, 2,24% несут indel мутации, а остальные 59,84% являются диким типом.
В локусе HBB 11,5% несут точную мутацию E6V, 35,4% несут indel мутации, а остальные 65% дикого типа. Cas9 RNP является предпочтительной формой Cas9 из-за его меньшего размера по сравнению с плазмидной ДНК. Электродпорация трубки является эффективным методом доставки Cas9 RNP.
Мы особенно заинтересованы в использовании трубчатого электропорации Cas9 RNP в первичных Т-клетках для применения CAR T.
