Entregar com segurança e eficácia elementos Cas9 nas células é fundamental para terapias baseadas em edição de genes. Os protocolos que mostramos aqui mostram uma nova abordagem nessa direção. O protocolo utiliza um novo método de eletroporação chamado eletroporação de tubos.
Isso leva a altas taxas de sobrevivência celular, bem como taxas de edição de genes. O método de eletroporação do tubo é vírus, droga, e o enriquecimento repórter livre. Estes são preferidos em aplicações clínicas, por isso, com terapias baseadas em edição de genes.
O método é universalmente aplicável a muitos tipos de células. Por exemplo, células hematopoiéticas humanas, células T primárias e outras células podem ser editadas usando nosso método. Este método de eletroporação do tubo usa um tubo fino.
Se você é um usuário de primeira vez, você pode tentar GFP expressando DNA plasmídeo. Demonstrando o procedimento será Linyuan Ma, um pós-doutor do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adquira iPSCs humanos da American Type Culture Collection.
Cultura os iPSCs em matriz extracelular artificial com meio de cultura celular livre de alimentador em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono seguindo as instruções do fornecedor. Duas horas antes da transfecção tratar os iPSCs com 10 micromolar rho-associated bobina enrolada contendo inibidor de proteína quinase Y-27632. Ao transfetar, dissociar iPSCs com solução de descolamento celular para células únicas a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Então conte o número de células. Para estabelecer uma cultura de células fibroblastos de coelho obtenha uma biópsia da pele da orelha da ponta de uma orelha de coelho. Enxágüe o tecido duas vezes com DPBS contendo 5% de penicilina-estreptomicina.
Transfira o tecido da orelha enxaguado para um novo prato de cultura tecidual de seis centímetros e corte o tecido em pequenos pedaços, cada um cerca de um por um milímetro. Adicione algumas gotas de FBS para evitar que o tecido seque. Depois disso, espalhe o tecido desfiado em um prato de cultura de tecido de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de meio de cultura.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias. Três a cinco dias após o uso de revestimento Trypsin-EDTA para digerir as células a 37 graus Celsius por dois minutos, em seguida, contar o número de células. Depois de projetar e sintetizar os gRNAs e oligos doadores, prepare as células como descrito anteriormente.
Resuspend 20 a 30.000 células em 20 microliters de tampão de eletroporação. Pipeta para cima e para baixo cuidadosamente para produzir uma única suspensão celular. Para transfecção Cas9 RNP, pré-misture dois microgramas de proteína Cas9 NLS com 0,67 microgramas de gRNA em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
Misture suavemente o complexo RNP formado com dois microgramas de ssODN com células. Usando dicas universais de pipeta do kit de eletroporação, transfira a mistura celular para um tubo de eletroporação de 20 microliter. Coloque o tubo de eletroporação na ranhura do eletroporador e pressione para terminar.
Um ciclo de eletroporação bem sucedido é indicado pelo relatório de pulso na tela de exibição do eletroporador. Após a eletroporação transferir as células iPS humanas para um mililitro de Y-27632 pré-aquecido contendo meio de cultura como descrito anteriormente. Em seguida, emplaque as células resuspended em um poço de uma placa de cultura celular de 12 poços.
Continue a cultivar o prato, certificando-se de mudar o meio de cultura todos os dias. Y-27632 é removido do meio de cultura iPSC humano 24 horas após a eletroporação. 72 horas após a eletroporação, colmeia as células.
Para células de fibroblasto de coelho, use Trypsin-EDTA para digerir as células da placa de cultura. Para iPSCs humanos, use solução de descolamento celular para digerir as células das placas de cultura. Centrifugar brevemente as amostras a 1000 rpm por cinco minutos, e resuspensar as células com 350 mililitros de tampão de lise.
Incubar durante a noite a 55 graus Celsius. No dia seguinte extrair o DNA genômico com fenol-clorofórmio usando procedimentos padrão. Amplie de 100 a 200 bases pares de fragmentos de DNA de géis usando um kit de extração de gel ou diretamente de produtos PCR usando um mini kit PCR SV.
Para determinar a eficiência de edição de genes por sequenciamento de colônias bacterianas, use um kit de clonagem TOPO-TA para ligar os produtos PCR purificados em um vetor PCR4-TOPO. Pegue aleatoriamente clones bacterianos e sequencie as pastilhas usando um primer de sequenciamento universal fornecido pelo kit de clonagem TOPO-TA. Para determinar a eficiência de edição de genes por sequenciamento profundo, envie os produtos PCR purificados previamente obtidos para sequenciamento crispr amplicon em um núcleo de sequenciamento de DNA.
Neste estudo, um método de eletroporação de tubos é efetivamente usado para fornecer CRISPR/Cas9 RNP e SsODNs para células coelhos e humanas, levando a uma edição de genes robusta e precisa. Primeiro, as mutações C231Y e Q235X são produzidas no gene IL2RG, e a mutação R150G é produzida no gene SPR em células fibroblastos de coelho. Os desenhos sgRNA específicos e as taxas de edição de genes determinadas pela clonagem de TA bacteriana são mostrados aqui.
O lócus IL2RG C231, dos 28 clones sequenciados, um carrega a mutação C231Y precisa, quatro mutações de inserção ou exclusão de transporte, e os 23 restantes são do tipo selvagem. No lócus IL2RG Q235, dos 27 clones sequenciados, dois carregam a mutação precisa de Q235X, três carregam uma mutação indel, e o restante é tipo selvagem. No lócus SPG R150, dos 20 clones sequenciados, cinco carregam a mutação genética R150 precisa, 10 carregam mutações indel, e o restante é do tipo selvagem.
A eletroporação de tubos é então usada para fornecer Cas9 RNP e ssODNs para iPSCs humanos e atingir loci clinicamente relevante nos genes EGFR, Mybpc3 e HBB. No lócus EGFR, 15,68% dos alelos carregam as mutações precisas de pontos, 22,75% carregam mutações indelés e os 61,57% restantes são do tipo selvagem. No lócus Mybpc3, 37,92% carregam a exclusão de TGAA de quatro pares base precisos, 2,24% carregam mutações indel e os 59,84% restantes são do tipo selvagem.
No lócus do HBB, 11,5% carregam a mutação precisa do E6V, 35,4% carregam mutações indel e os 65% restantes são do tipo selvagem. Cas9 RNP é a forma preferida de Cas9 devido ao seu tamanho menor em comparação com o DNA plasmídeo. A eletroporação do tubo é um método eficaz para entregar Cas9 RNP.
Estamos particularmente interessados em utilizar a eletroporação de tubo de Cas9 RNP em células T primárias para aplicações CAR T.
