Cas9 elemanlarının güvenli ve etkili bir şekilde hücrelere teslim ilerler, gen düzenleme temelli tedaviler için çok önemlidir. Burada gösterdiğimiz protokoller bu yönde yeni bir yaklaşım sergiliyor. Protokol, tüp elektroporasyon adı verilen yeni bir elektroporasyon yöntemini kullanmaktadır.
Bu yüksek hücresel sağkalım oranları yanı sıra gen düzenleme oranları yol açar. Tüp elektroporasyon yöntemi virüs, ilaç ve muhabir zenginleştirme ücretsizdir. Bunlar klinik uygulamalarda tercih edilir, bu nedenle gen düzenleme tabanlı tedaviler ile.
Yöntem evrensel olarak birçok hücre türleri için geçerlidir. Örneğin insan hematopoetik hücreleri, birincil T hücreleri ve diğer hücrelerin hepsi bizim yöntemimiz kullanılarak düzenlenebilir. Bu tüp elektroporasyon yöntemi ince bir tüp kullanır.
Eğer ilk kez kullanıcı iseniz, plazmid DNA ifade GFP deneyebilirsiniz. Prosedürü gösteren Linyuan Ma, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olacak. Bu yordamı başlatmak için Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan insan iPSC'leri edinin.
Kültür bir hücre kültürü kuluçka 37 santigrat derecede besleyici içermeyen hücre kültürü orta ile yapay hücre dışı matris üzerinde iPSCs tedarikçinin talimatları aşağıdaki% 5 karbondioksit ile. Transfeksiyondan iki saat önce iPSC'leri protein kiaz inhibitörü Y-27632 içeren 10 mikromolar Rho ilişkili sarmal bobin ile tedavi edin. Transfecting, hücre ayırma çözeltisi ile iPSCs ayrıştırın tek hücrelere 37 santigrat derece beş dakika.
Sonra hücre sayısını sayın. Bir tavşan fibroblast hücre kültürü kurmak için bir tavşan kulağının ucundan bir kulak derisi biyopsisi elde. %5 penisilin-streptomisin içeren DPBS ile iki kez doku durular.
Durulanan kulak dokusunu altı santimetrelik yeni bir doku kültür yemeğine aktarın ve dokuyu her biri bir milimetre kadar küçük parçalara ayırın. Dokuların kurumasını önlemek için birkaç damla FBS ekleyin. Bundan sonra, 10 santimetre lik doku kültür yemeği parçalanmış doku yayıldı ve kültür orta 10 mililitre ekleyin.
Hücreleri 37 derecede %5 karbondioksitle 3-5 gün kuluçkaya yatırın. Kaplamadan 3-5 gün sonra trypsin-EDTA kullanarak hücreleri 37 derecede iki dakika sindirin, sonra da hücre sayısını sayar. GRNA'ları ve donör oligoları tasarlayıp sentezledikten sonra, hücreleri daha önce açıklandığı gibi hazırlayın.
20 mikrolitre elektroporasyon tamponunda 20 ila 30, 000 hücreyi yeniden askıya alın. Pipet yukarı ve aşağı dikkatle tek bir hücre süspansiyon üretmek için. Cas9 RNP transfeksiyonu için iki mikrogram Cas9 NLS proteinini oda sıcaklığında 0,67 mikrogram gRNA ile 10 ila 15 dakika önceden karıştırın.
Oluşan RNP kompleksini iki mikrogram ssODN ile hücrelerle hafifçe karıştırın. Elektroporasyon kitinden elde edilen evrensel pipet uçlarını kullanarak hücre karışımını 20 mikrolitrelik bir elektroporasyon tüpüne aktarın. Elektroporasyon tüpünü elektroporatörün yuvasına yerleştirin ve bitirmek için basın.
Başarılı bir elektroporasyon döngüsü elektroporatörün ekran ekranındaki darbe raporu ile gösterilir. Elektroporasyondan sonra insan iPS hücrelerini daha önce açıklandığı gibi kültür ortamı içeren bir mililitre önceden ısıtılmış Y-27632'ye aktarır. Sonra 12 kuyulu hücre kültür plakasının bir kuyusunda yeniden açığa alınan hücreleri plakalayın.
Her gün kültür ortamını değiştirmek için emin olun, plaka culturing devam edin. Y-27632 elektroporasyon dan 24 saat sonra insan iPSC kültür ortamı kaldırılır. Elektroporasyondan 72 saat sonra hücreleri hasat edin.
Bir tavşan fibroblast hücreleri için, kültür plaka hücreleri sindirmek için Tripsin-EDTA kullanın. İnsan iPSCs için kültür plakaları hücreleri sindirmek için hücre ayırma çözümü kullanın. Örnekleri 1000 rpm'de beş dakika süreyle kısaca santrifüj edin ve 350 mililitre likiz tamponu ile hücreleri yeniden askıya alın.
Bir gecede 55 santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün standart prosedürleri kullanarak fenol-kloroform ile genomik DNA ayıklayın. Jel çıkarma kiti veya doğrudan PCR SV mini kiti kullanarak jellerden 100 ila 200 baz dna parçasını yükseltin.
Bakteri kolonisi dizilimi ile gen düzenleme verimliliğini belirlemek için, saflaştırılmış PCR ürünlerini PCR4-TOPO vektörüne dönüştürmek için bir TOPO-TA klonlama kiti kullanın. Rastgele bakteriyel klonları almak ve TOPO-TA klonlama kiti tarafından sağlanan evrensel bir sıralama astar kullanarak ekler sıralamak. Gen düzenleme verimliliğini derin sıralama ile belirlemek için, daha önce elde edilmiş saflaştırılmış PCR ürünlerini BIR DNA dizileme çekirdeğine CRISPR amplicon sıralaması için gönderin.
Bu çalışmada crispr/Cas9 RNP ve ssODN'leri tavşan ve insan hücrelerine ulaştırmak için bir tüp elektroporasyon yöntemi etkin bir şekilde kullanılmakta ve sağlam ve hassas gen düzenlemesine yol açılmıştır. İlk olarak IL2RG geninde C231Y ve Q235X mutasyonları, tavşan fibroblast hücrelerinde SPR geninde R150G mutasyonu üretilir. Spesifik sgRNA tasarımları ve bakteriyel TA klonlama ile belirlenen gen düzenleme oranları burada gösterilmiştir.
IL2RG C231 locus, dizili 28 klondan biri c231Y mutasyonu, dördü ekleme veya silme mutasyonu taşır, geri kalan 23'ü ise yabani tiptir. IL2RG Q235 locus'ta, dizili 27 klondan ikisi kesin Q235X mutasyonunu taşır, üçü indel mutasyonu taşır, geri kalan ise yabani tiptir. SPG R150 locus'ta, dizili 20 klondan beşi kesin R150 gen mutasyonu, 10'u indel mutasyonu taşır ve geri kalanlar vahşi tiptir.
Tüp elektroporasyon daha sonra insan iPSCs cas9 RNP ve ssODNs teslim etmek ve EGFR, Mybpc3 ve HBB genleri klinik olarak ilgili loci hedef kullanılır. EGFR lokusunda alellerin %15.68'i kesin nokta mutasyonları, %22.75'i indel mutasyonu, geri kalan %61.57'si yabani tiptir. Mybpc3 locus anda, 37.92% hassas dört baz çifti TGAA silme taşımak, 2.24% indel mutasyonları taşımak, ve kalan 59.84% yabani türüvardır.
HBB locusunda %11.5'i hassas E6V mutasyonu, %35.4'ü indel mutasyonu, geri kalan %65'i ise yabani tiptir. Cas9 RNP plazmid DNA'ya göre daha küçük boyutu nedeniyle Cas9'un tercih edilen şeklidir. Tüp elektroporasyon Cas9 RNP sunmak için etkili bir yöntemdir.
Özellikle CAR T uygulamaları için primer T hücrelerinde Cas9 RNP tüp elektroporasyonu kullanmak la ilgileniyoruz.
