Die sichere und effektive Bereitstellung von Cas9-Elementen in Zellen ist entscheidend für geneditingbasierte Therapien. Die Protokolle, die wir hier zeigen, zeigen einen neuartigen Ansatz in diese Richtung. Das Protokoll verwendet eine neue Elektroporationsmethode namens Röhrenelektroporation.
Dies führt zu hohen zellulären Überlebensraten sowie Gen-Editing-Raten. Die TubeElektroporation Methode ist Virus, Medikament, und der Reporter Anreicherung frei. Diese werden in klinischen Anwendungen bevorzugt, also bei Gen-Editing-basierten Therapien.
Die Methode ist universell auf viele Zelltypen anwendbar. Beispielsweise können menschliche hämatopoetische Zellen, primäre T-Zellen und andere Zellen mit unserer Methode bearbeitet werden. Dieses Rohrelektroporationsverfahren verwendet ein dünnes Rohr.
Wenn Sie ein erstmaliger Benutzer sind, können Sie versuchen, GFP-Exzid-DNA auszudrücken. Demonstrieren daterisch wird Linyuan Ma sein, ein Postdoc aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwerben Sie menschliche iPSCs aus der American Type Culture Collection.
Kultur die iPSCs auf künstliche nextrazelluläre Matrix mit feederfreien Zellkulturmedium in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid nach den Anweisungen des Lieferanten. Zwei Stunden vor der Transfektion behandeln Sie die iPSCs mit 10 mikromolaren Rho-assoziierten Coiled Coils, die Proteinkinase-Inhibitor Y-27632 enthalten. Dissoziieren Sie bei der Transfezierung iPSCs mit Zellablösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer Zellablösung.
Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen. Um eine Kaninchen-Fibroblasten-Zellkultur zu etablieren, erhalten Sie eine Ohrhautbiopsie von der Spitze eines Kaninchenohrs. Spülen Sie das Gewebe zweimal mit DPBS, das 5%Penicillin-Streptomycin enthält.
Übertragen Sie das vorgerinnte Ohrgewebe auf eine neue sechs Zentimeter große Gewebekulturschale und schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke, jeweils etwa eins um einen Millimeter. Fügen Sie ein paar Tropfen FBS hinzu, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet. Danach das geschredderte Gewebe in einem 10 Zentimeter großen Gewebekulturgericht verteilen und 10 Milliliter Kulturmedium hinzufügen.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei bis fünf Tage. Drei bis fünf Tage nach der Beschichtung verwenden Trypsin-EDTA, um die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten zu verdauen, dann zählen Sie die Anzahl der Zellen. Nach dem Entwerfen und Synthesisieren der gRNAs und Spenderoligos, bereiten Sie die Zellen wie zuvor beschrieben.
20 bis 30 000 Zellen in 20 Mikroliter Elektroporationspuffer wieder aufsetzen. Pipette vorsichtig nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Für Cas9 RNP-Transfektion, vormischen Sie zwei Mikrogramm Cas9 NLS Protein mit 0,67 Mikrogramm gRNA bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten.
Mischen Sie den gebildeten RNP-Komplex vorsichtig mit zwei Mikrogramm ssODN mit Zellen. Übertragen Sie die Zellmischung mit universellen Pipettenspitzen aus dem Elektroporationskit auf ein 20-Mikroliter-Elektroporationsrohr. Legen Sie das Elektroporationsrohr in den Schlitz des Elektroporators und drücken Sie gehen, um zu beenden.
Ein erfolgreicher Elektroporationszyklus wird durch den Impulsbericht auf dem Bildschirm des Elektroporators angezeigt. Nach der Elektroporation übertragen die menschlichen iPS-Zellen auf einen Milliliter vorgewärmtes Y-27632, das wie zuvor beschrieben ein Kulturmedium enthält. Dann die resuspendierten Zellen in einem Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte verkleben.
Kultivieren Sie die Platte, stellen Sie sicher, dass das Kulturmedium jeden Tag zu ändern. Y-27632 wird 24 Stunden nach der Elektroporation aus dem humanen iPSC-Kulturmedium entfernt. 72 Stunden nach der Elektroporation die Zellen ernten.
Für ein Kaninchen Fibroblastenzellen, Verwenden Sie Trypsin-EDTA, um die Zellen von der Kulturplatte zu verdauen. Für menschliche iPSCs verwenden Zellablösung, um die Zellen von den Kulturplatten zu verdauen. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 1000 U/min und setzen Sie die Zellen mit 350 Milliliterlysepuffer wieder auf.
Über Nacht bei 55 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag extrahieren Sie die genomische DNA mit Phenol-Chloroform nach Standardverfahren. Verstärken Sie 100 bis 200 Basen Paare von DNA-Fragmenten von Gelen mit entweder einem Gel-Extraktions-Kit oder direkt aus PCR-Produkten mit einem PCR SV Mini-Kit.
Um die Effizienz der Genbearbeitung durch bakterielle Koloniesequenzierung zu bestimmen, verwenden Sie ein TOPO-TA-Klonkit, um die gereinigten PCR-Produkte in einen PCR4-TOPO-Vektor zu unterstellen. Nehmen Sie zufällig bakterielle Klone auf und sequenzieren Sie die Einsätze mit einem universellen Sequenzierungsprimer, der vom TOPO-TA-Klonkit bereitgestellt wird. Um die Effizienz der Genbearbeitung durch tiefe Sequenzierung zu bestimmen, senden Sie die zuvor erhaltenen gereinigten PCR-Produkte für die CRISPR-Amplicon-Sequenzierung in einen DNA-Sequenzierungskern.
In dieser Studie wird eine Tube-Elektroporation-Methode effektiv verwendet, um CRISPR/Cas9 RNP und ssODNs an Kaninchen und menschliche Zellen zu liefern, was zu einer robusten, präzisen Genbearbeitung führt. Zunächst werden C231Y- und Q235X-Mutationen im IL2RG-Gen und die R150G-Mutation im SPR-Gen in Kaninchen-Fibroblastenzellen produziert. Die spezifischen sgRNA-Designs und die durch bakterielles TA-Klonen ermittelten Gen-Editing-Raten werden hier gezeigt.
Der IL2RG C231-Lokus, von den 28 gesequenzten Klonen, trägt die präzise C231Y-Mutation, vier tragen Insertions- oder Deletionsmutationen, und die restlichen 23 sind Wildtyp. Am IL2RG Q235-Lokus tragen von den 27 sequenzierten Klonen zwei die präzise Q235X-Mutation, drei eine Indelmutation, und die übrigen sind Wildtyp. Am SPG R150 locus tragen fünf der 20 gesequenzen Klone die präzise R150-Genmutation, 10 tragen Indelmutationen, und die übrigen sind Wildtyp.
Die Tubenelektroporation wird dann verwendet, um Cas9 RNP und ssODNs an menschliche iPSCs zu liefern und klinisch relevante Loci in EGFR-, Mybpc3- und HBB-Genen zu zielen. Am EGFR-Ort tragen 15,68% der Allele die genauen Punktmutationen, 22,75% tragen Indelmutationen, und die restlichen 61,57% sind Wildtyp. Am Mybpc3-Lokus tragen 37,92% die präzise vier Basispaar-TGAA-Deletion, 2,24% tragen Indelmutationen, und die restlichen 59,84% sind Wildtyp.
Am HBB-Ort tragen 11,5% die genaue E6V-Mutation, 35,4% tragen Indelmutationen, und die restlichen 65% sind Wildtyp. Cas9 RNP ist die bevorzugte Form von Cas9 aufgrund seiner kleineren Größe im Vergleich zu Plasmid-DNA. Die Rohrelektroporation ist eine effektive Methode, um Cas9 RNP zu liefern.
Wir sind besonders daran interessiert, die Rohrelektroporation von Cas9 RNP in primären T-Zellen für CAR-T-Anwendungen zu verwenden.
