세포에 Cas9 요소를 안전하고 효과적으로 전달하는 것은 유전자 편집 기반 치료에 매우 중요합니다. 여기에 표시되는 프로토콜은 그 방향으로 새로운 접근 방식을 표시합니다. 이 프로토콜은 튜브 전기기화라는 새로운 전기 포기법을 활용합니다.
이것은 유전자 편집 비율 뿐만 아니라 높은 세포 생존율로 이끌어 냅니다. 관 전포 방법은 바이러스, 약물 및 리포터 농축이 없습니다. 이들은 임상 응용 프로그램에서 선호, 그래서 유전자 편집 기반 치료.
이 방법은 보편적으로 많은 세포 유형에 적용됩니다. 예를 들어 인간 조혈 세포, 1 차 T 세포 및 기타 세포는 모두 우리의 방법을 사용하여 편집 할 수 있습니다. 이 튜브 전기 화 방법은 얇은 튜브를 사용합니다.
처음 사용자라면 Plasmid DNA를 표현하는 GFP를 시도할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 포스트 닥인 Linyuan Ma가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 미국 식 문화 컬렉션에서 인간 iPSC를 획득합니다.
공급 업체의 지시에 따라 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 세포 배양 배양 배지를 가진 인공 세포 외 매트릭스에 iPSC를 배양. 전환 2시간 전에 iPSC를 단백질 키나아제 억제제 Y-27632를 함유한 10개의 마이크로몰라 Rho-관련 코일-코일로 치료한다. 전염시, 5분 동안 섭씨 37도에서 단일 세포에 세포 분리 용액을 가진 iPSC를 5분 동안 분리한다.
그런 다음 셀 수를 계산합니다. 토끼 섬유아세포 배양을 확립하기 위해 토끼 귀 끝에서 귀 피부생검을 얻습니다. 5%페니실린-연쇄절제술을 함유한 DPBS로 조직을 두 번 헹구는 다.
헹구는 귀 조직을 새로운 6센티미터 조직 배양 접시에 옮기고 조직을 작은 조각으로 잘라내고 각각 약 1밀리미터씩 잘라냅니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 몇 방울의 FBS를 추가하십시오. 그 후, 분쇄 된 조직을 10 센티미터 조직 배양 접시에 확산시키고 배양 배지의 10 밀리리터를 추가하십시오.
3~5일 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 세포를 배양합니다. 도금 후 3 ~5 일 트립신-EDTA를 사용하여 2 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 소화한 다음 세포 수를 계산합니다. gRNA 및 기증자 올리고를 설계하고 합성한 후, 이전에 설명한 대로 세포를 준비한다.
전기 기화 완충제의 20 마이크로 리터에서 20 ~ 30, 000 세포를 다시 중단합니다. 파이펫을 조심스럽게 위아래로 기울여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. Cas9 RNP 트랜스퍼션의 경우 실온에서 0.67 마이크로그램의 gRNA를 10~15분 동안 Cas9 NLS 단백질 2마이크로그램과 사전 혼합합니다.
형성된 RNP 콤플렉스를 ssODN 의 두 마이크로그램과 셀을 부드럽게 혼합합니다. 전기 포기 키트에서 범용 파이펫 팁을 사용하여 세포 혼합물을 20 마이크로 리터 전기 포기 튜브로 옮춥니다. 전기 포라기의 슬롯에 전기 포기 튜브를 놓고 눌러 마무리합니다.
성공적인 전기포기 주기는 전기포레이터의 디스플레이 스크린에 대한 펄스 보고서에 의해 표시됩니다. 전기기화 후 인간 iPS 세포는 이전에 설명된 바와 같이 배양 배지를 함유하는 사전 온난화 Y-27632의 1밀리리터로 전달한다. 그런 다음 12웰 세포 배양 판의 한 웰에 다시 중단 된 세포를 접시.
접시를 계속 배양하여 매일 배양 매체를 변경하십시오. Y-27632는 인간 iPSC 배양 배지로부터 24시간 후 전기포기후 제거된다. 전기 기화 후 72 시간, 세포를 수확.
토끼 섬유아세포 세포의 경우 트립신-EDTA를 사용하여 배양 판에서 세포를 소화하십시오. 인간 iPSC의 경우 세포 분리 솔루션을 사용하여 배양 판에서 세포를 소화합니다. 샘플을 5분 동안 1000 rpm에서 간략하게 원심분리하고 350밀리리터의 용해 완충제로 세포를 다시 분리합니다.
섭씨 55도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 표준 절차를 사용하여 페놀 클로로폼으로 게놈 DNA를 추출합니다. 젤 추출 키트를 사용하거나 PCR SV 미니 키트를 사용하여 PCR 제품에서 직접 100~200개의 젤의 DNA 조각을 증폭시합니다.
세균성 식민지 시퀀싱에 의한 유전자 편집 효율을 결정하기 위해 TOPO-TA 복제 키트를 사용하여 정제된 PCR 제품을 PCR4-TOPO 벡터로 리게이트합니다. TOPO-TA 복제 키트에서 제공하는 범용 시퀀싱 프라이머를 사용하여 세균 클론을 임의로 선택하고 인서트를 시퀀싱합니다. 심층 시퀀싱에 의한 유전자 편집 효율을 결정하기 위해, DNA 염기서열 분석 코어에서 CRISPR 앰플리시온 염기서열분석용 이전에 획득한 정제PCR 제품을 보냅니다.
이 연구에서 튜브 전기화 방법은 효과적으로 CRISPR / Cas9 RNP 및 ssODN을 토끼와 인간 세포에 전달하는 데 사용되어 견고하고 정밀한 유전자 편집으로 이어진다. 첫째, C231Y 및 Q235X 돌연변이는 IL2RG 유전자에서 생성되고, R150G 돌연변이는 토끼 섬유아세포 세포내의 SPR 유전자에서 생산된다. 세균성 TA 복제에 의해 결정된 특정 sgRNA 설계 및 유전자 편집 속도는 여기에서 도시된다.
IL2RG C231 궤적, 28클론 시퀀싱 중 하나, 정밀한 C231Y 돌연변이, 4개의 캐리 삽입 또는 삭제 돌연변이를 운반하고, 나머지 23개는 야생형이다. IL2RG Q235 궤적에서, 27클론 중 2개는 정확한 Q235X 돌연변이를 수행하고, 3개는 인델 돌연변이를 가지고 있으며, 나머지는 야생형이다. SPG R150 궤적에서, 20클론 시퀀스, 5개는 정확한 R150 유전자 돌연변이를 전송하고, 10개의 인델 돌연변이를 운반하고, 나머지는 야생형이다.
튜브 전기화는 인간 iPSC에 Cas9 RNP 및 ssODN을 전달하고 EGFR, Mybpc3 및 HBB 유전자에서 임상적으로 관련있는 loci를 표적으로 하는 데 사용됩니다. EGFR 궤적에서, 15.68%의 알렐은 정확한 점 돌연변이를, 22.75%는 인델 돌연변이를 운반하고, 나머지 61.57%는 야생형이다. Mybpc3 궤적에서 37.92%는 정확한 4개의 염기 쌍 TGAA 삭제, 2.24%의 인델 돌연변이를 운반하고 나머지 59.84%는 야생유형이다.
HBB 궤적에서 11.5%는 정확한 E6V 돌연변이를 운반하고, 35.4%는 인델 돌연변이를 운반하고, 나머지 65%는 야생형이다. Cas9 RNP는 플라스미드 DNA에 비해 크기가 작기 때문에 Cas9의 바람직한 형태입니다. 관 전기화는 Cas9 RNP를 전달하는 효과적인 방법입니다.
우리는 특히 CAR T 응용 프로그램에 대한 기본 T 세포에서 Cas9 RNP의 튜브 전기 포기공을 활용하는 데 관심이 있습니다.
