La entrega segura y eficaz de elementos Cas9 en las células es fundamental para las terapias basadas en la edición de genes. Los protocolos que mostramos aquí muestran un enfoque novedoso en esa dirección. El protocolo utiliza un nuevo método de electroporación llamado electroporación de tubos.
Esto conduce a altas tasas de supervivencia celular, así como tasas de edición de genes. El método de electroporación de tubos es libre de virus, drogas y el enriquecimiento del reportero. Estos son preferidos en aplicaciones clínicas, por lo que con terapias basadas en la edición genética.
El método es universalmente aplicable a muchos tipos de celda. Por ejemplo, las células hematopoyéticas humanas, las células T primarias y otras células se pueden editar utilizando nuestro método. Este método de electroporación de tubo utiliza un tubo delgado.
Si eres un usuario por primera vez, puedes probar GFP expresando ADN plásmido. Demostrar el procedimiento será Linyuan Ma, un postdoctorado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento adquirir iPSCs humanos de la American Type Culture Collection.
Cultivo de los iPSC en matriz extracelular artificial con medio de cultivo celular libre de alimentación en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono siguiendo las instrucciones del proveedor. Dos horas antes de la transfección tratar los iPSC con 10 micromolarEsel Rho-asociado Rho-asociado bobina enrollada que contiene inhibidor de la proteína quinasa Y-27632. Al transfecctar, disocia iPSCs con solución de desprendimiento celular a células individuales a 37 grados Celsius durante cinco minutos.
A continuación, cuente el número de celdas. Para establecer un cultivo celular de fibroblastos de conejo, obtenga una biopsia de piel de oído de la punta de una oreja de conejo. Enjuague el tejido dos veces con DPBS que contenga 5%penicilina-estreptomicina.
Transfiera el tejido auditivo enjuagado a un nuevo plato de cultivo de tejido de seis centímetros y corte el tejido en trozos pequeños, cada uno de unos por uno milímetro. Agregue unas gotas de FBS para evitar que el tejido se seque. Después de esto, esparza el tejido rallado en un plato de cultivo de tejido de 10 centímetros y agrega 10 mililitros de medio de cultivo.
Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres a cinco días. De tres a cinco días después del enchapado, utilice Trypsin-EDTA para digerir las células a 37 grados Celsius durante dos minutos, luego cuente el número de células. Después de diseñar y sintetizar los gRNAs y los oligos de donantes, prepare las células como se describió anteriormente.
Resuspender de 20 a 30.000 células en 20 microlitros de tampón de electroporación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con cuidado para producir una sola célula de suspensión. Para la transfección Cas9 RNP, premezcla dos microgramos de proteína Cas9 NLS con 0,67 microgramos de ARNneso a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos.
Mezclar suavemente el complejo RNP formado con dos microgramos de ssODN con células. Usando puntas de pipeta universales del kit de electroporación, transfiera la mezcla celular a un tubo de electroporación de 20 microlitrotros. Coloque el tubo de electroporación en la ranura del electroporador y pulse para terminar.
Un ciclo de electroporación exitoso se indica mediante el informe de pulso en la pantalla del electroporador. Después de la electroporación transferir las células iPS humanas a un mililitro de Y-27632 precale calentado que contiene medio de cultivo como se describió anteriormente. A continuación, plato de las células resuspendidas en un pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos.
Continúe cultivando el plato, asegurándose de cambiar el medio de cultivo todos los días. Y-27632 se retira del medio de cultivo iPSC humano 24 horas después de la electroporación. 72 horas después de la electroporación, cosechar las células.
Para las células de fibroblastos de conejo, utilice Trypsin-EDTA para digerir las células de la placa de cultivo. Para iPSC humanos, utilice la solución de desprendimiento celular para digerir las células de las placas de cultivo. Centrifugar brevemente las muestras a 1000 rpm durante cinco minutos, y resuspender las células con 350 mililitros de tampón de lelisis.
Incubar durante la noche a 55 grados centígrados. Al día siguiente extrae el ADN genómico con fenol-cloroformo utilizando procedimientos estándar. Amplifique de 100 a 200 bases pares de fragmentos de ADN de geles utilizando un kit de extracción de gel o directamente de productos PCR utilizando un mini kit PCR SV.
Para determinar la eficiencia de edición de genes mediante la secuenciación de colonias bacterianas, utilice un kit de clonación TOPO-TA para ligar los productos de PCR purificados en un vector PCR4-TOPO. Recoja aleatoriamente clones bacterianos y secuencia las plaquitas utilizando una imprimación de secuenciación universal proporcionada por el kit de clonación TOPO-TA. Para determinar la eficiencia de edición de genes mediante la secuenciación profunda, envíe los productos de PCR purificados previamente obtenidos para la secuenciación de amplicon CRISPR en un núcleo de secuenciación de ADN.
En este estudio se utiliza eficazmente un método de electroporación de tubos para entregar CRISPR/Cas9 RNP y ssODNs a células de conejo y humanos, lo que conduce a una edición genética robusta y precisa. En primer lugar, las mutaciones C231Y y Q235X se producen en el gen IL2RG, y la mutación R150G se produce en el gen SPR en las células de fibroblastos de conejo. Los diseños específicos de sgRNA y las tasas de edición genética determinadas por la clonación bacteriana de TA se muestran aquí.
El locus IL2RG C231, de los 28 clones secuenciados, uno lleva la mutación precisa C231Y, cuatro mutaciones de inserción o eliminación de transporte, y los 23 restantes son de tipo salvaje. En el locus IL2RG Q235, de los 27 clones secuenciados, dos llevan la mutación Q235X precisa, tres llevan una mutación indel, y los restantes son de tipo salvaje. En el locus R150 de la AAP, de los 20 clones secuenciados, cinco llevan la mutación precisa del gen R150, 10 mutaciones de indel, y el resto son de tipo salvaje.
La electroporación de tubos se utiliza entonces para entregar Cas9 RNP y ssODNs a iPSCs humanos y apuntar a loci clínicamente relevantes en los genes EGFR, Mybpc3 y HBB. En el locus egFR, el 15,68% de los alelos llevan las mutaciones puntuales precisas, el 22,75% transporta mutaciones indel y el 61,57% restante son de tipo salvaje. En el locus Mybpc3, el 37,92% lleva la deleción precisa de TGAA de cuatro pares base, el 2,24% de las mutaciones indel y el 59,84% restante son de tipo salvaje.
En el locus HBB, el 11,5% lleva la mutación E6V precisa, el 35,4% lleva mutaciones indel y el 65% restante son de tipo salvaje. Cas9 RNP es la forma preferida de Cas9 debido a su tamaño más pequeño en comparación con el ADN plásmido. La electroporación del tubo es un método eficaz para suministrar Cas9 RNP.
Estamos particularmente interesados en utilizar la electroporación de tubos de Cas9 RNP en células T primarias para aplicaciones CAR T.
