בבטחה וביעילות אספקת אלמנטים Cas9 לתאים היא קריטית עבור טיפולים מבוססי עריכת גנים. הפרוטוקולים שאנו מראים כאן מציגים גישה חדשנית בכיוון זה. הפרוטוקול משתמש בשיטת אלקטרופורציה חדשה הנקראת אלקטרופורציה של צינור.
זה מוביל שיעורי הישרדות הסלולר גבוהים, כמו גם שיעורי עריכת גנים. שיטת אלקטרופולציה צינור הוא וירוס, סמים, ואת הכתב העשרה חינם. אלה מועדפים ביישומים קליניים, כך עם טיפולים מבוססי עריכת גנים.
השיטה ישימה באופן אוניברסלי לסוגי תאים רבים. לדוגמה, תאים hematopoietic אנושי, תאי T ראשיים, ותאים אחרים ניתן לערוך כל באמצעות השיטה שלנו. שיטת אלקטרופולציה צינור זה משתמש בצינור דק.
אם אתה משתמש בפעם הראשונה, אתה יכול לנסות GFP להביע DNA פלסמיד. הדגמת ההליך תהיה ליניואן מא, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל הליך זה לרכוש iPSCs אנושי מאוסף תרבות סוג אמריקאי.
תרבות iPSCs על מטריצה חוץ תאית מלאכותית עם מדיום תרבות תאים ללא מאכילים ב חממה לתרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני בעקבות הוראות הספק. שעתיים לפני transfection לטפל iPSCs עם 10 micromolar Rho הקשורים סליל סליל המכיל מעכבי קינאז חלבון Y-27632. בעת חילוף, נתק iPSCs עם פתרון ניתוק תאים לתאים בודדים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן ספור את מספר התאים. כדי להקים תרבות תאים פיברובלסט ארנב לקבל ביופסיה עור האוזן מה קצה אוזן ארנב. יש לשטוף את הרקמה פעמיים עם DPBS המכיל 5%פניצילין-סטרפטומיצין.
מעבירים את רקמת האוזן המוזגת לצלחת חדשה של תרבות רקמת שישה ס"מ וחותכים את הרקמה לחתיכות קטנות, כל אחת על אחת על מילימטר. הוסף כמה טיפות של FBS כדי למנוע את הרקמה להתייבש. לאחר מכן, להפיץ את הרקמה מגוררת בצלחת תרבות רקמה 10 ס"מ ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום תרבות.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך שלושה עד חמישה ימים. שלושה עד חמישה ימים לאחר ציפוי להשתמש טריפסין-EDTA לעכל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, ולאחר מכן לספור את מספר התאים. לאחר תכנון וסינתזה של gRNAs ואוליגוס התורם, להכין את התאים כפי שתואר קודם לכן.
תן מחדש 20 עד 30, 000 תאים ב-20 מיקרוליטרים של מאגר אלקטרופולציה. פיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי לייצר השעיה תא יחיד. עבור Transfection Cas9 RNP, מערבבים מראש שני מיקרוגרם של חלבון Cas9 NLS עם 0.67 מיקרוגרם של gRNA בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות.
מערבבים בעדינות את קומפלקס RNP שנוצר עם שני מיקרוגרם של ssODN עם תאים. באמצעות טיפים פיפטה אוניברסלית מערכת electroporation, להעביר את תערובת התא לצינור אלקטרופולציה 20 microliter. מניחים את צינור האלקטרופולציה בחריץ של האלקטרופורטור ולחץ ללכת לסיים.
מחזור אלקטרופורציה מוצלח מסומן על ידי דו"ח הדופק על מסך התצוגה של האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופוריה להעביר את תאי iPS האנושיים למיליליטר אחד של Y-27632 מחומם מראש המכיל מדיום תרבות כפי שתואר קודם לכן. ואז צלחת התאים המתווסתים באר אחת של צלחת תרבות תאים 12 היטב.
המשך culturing את הצלחת, הקפד לשנות את מדיום התרבות כל יום. Y-27632 מוסר מן התרבות האנושית iPSC בינוני 24 שעות לאחר אלקטרופולציה. 72 שעות לאחר אלקטרופורציה, לקצור את התאים.
לתאי פיברובלסט ארנב, השתמש טריפסין-EDTA לעכל את התאים מצלחת התרבות. עבור iPSCs אנושי להשתמש בתסכול ניתוק תאים כדי לעכל את התאים מן לוחות התרבות. בקצרה צנטריפוגה הדגימות ב 1000 סל"ד במשך חמש דקות, ו resuspend התאים עם 350 מיליליטר של מאגר תמוגה.
דגירה לילה ב 55 מעלות צלזיוס. למחרת לחלץ את ה-DNA הגנומי עם פנול-כלורופורם באמצעות הליכים סטנדרטיים. הגבר 100 עד 200 זוגות בסיסים של שברי DNA מג'לים באמצעות ערכת מיצוי ג'ל או ישירות ממוצרים PCR באמצעות ערכת מיני PCR SV.
כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנים על-ידי ריצוף מושבת חיידקים, השתמש בערכת שיבוט TOPO-TA כדי לצרף את מוצרי PCR המטוהרים לווקטור PCR4-TOPO. איסוף אקראי של שיבוטים חיידקיים ורצף המכניסים באמצעות פריימר רצף אוניברסלי המסופק על-ידי ערכת השיבוט TOPO-TA. כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנים על-ידי ריצוף עמוק, שלח את מוצרי PCR המטוהרים שהושגו בעבר עבור רצף אמפייקון CRISPR בליבת ריצוף DNA.
במחקר זה נעשה שימוש יעיל בשיטת אלקטרופוזיה של צינור כדי לספק CRISPR/Cas9 RNP ו- ssODNs לארנב ולתאים אנושיים, מה שמוביל לעריכת גנים חזקה ומדויקת. ראשית, מוטציות C231Y ו- Q235X מיוצרות בגן IL2RG, והמוטציה R150G מיוצרת בגן SPR בתאי פיברובלסט ארנב. העיצובים הספציפיים של sgRNA ותעריפי עריכת הגנים שנקבעו על ידי שיבוט ת"א חיידקי מוצגים כאן.
לוקוס IL2RG C231, מתוך 28 השיבוטים ברצף, אחד נושא את המוטציה המדויקת C231Y, ארבע מוטציות הכנסה או מחיקה לשאת, ואת 23 הנותרים הם סוג פראי. ב- IL2RG Q235 locus, מתוך 27 השיבוטים ברצף, שניים נושאים את המוטציה המדויקת Q235X, שלושה נושאים מוטציה indel, והיתר הם מסוג בר. ב- SPG R150 locus, מתוך 20 השיבוטים ברצף, חמישה נושאים את המוטציה המדויקת בגן R150, 10 נושאים מוטציות אינדל, והיתר הם מסוג פראי.
אלקטרופוזיה צינור משמש לאחר מכן כדי לספק Cas9 RNP ו ssODNs iPSCs אנושיים ולמקד לוצי רלוונטי קלינית בגנים EGFR, Mybpc3, ו HBB. בלוקוס EGFR, 15.68% מהאלים נושאים את מוטציות הנקודה המדויקת, 22.75% נושאים מוטציות אינדל, ו-61.57% הנותרים הם מסוג פראי. במלון Mybpc3 locus, 37.92% נושאים את ארבעת הבסיסים המדויקים למחיקת TGAA, 2.24% נושאים מוטציות אינדל, ו-59.84% הנותרים הם מסוג פראי.
בלוקוס HBB, 11.5% נושאים את המוטציה E6V המדויקת, 35.4% נושאים מוטציות אינדל, ו-65% הנותרים הם מסוג פראי. Cas9 RNP היא הצורה המועדפת של Cas9 בשל גודלו הקטן יותר בהשוואה ל- DNA פלסמיד. אלקטרופורציה הצינור היא שיטה יעילה כדי לספק Cas9 RNP.
אנו מעוניינים במיוחד ניצול אלקטרופוזיה צינור של Cas9 RNP בתאי T ראשוניים עבור יישומי CAR T.
