La livraison sécuritaire et efficace des éléments Cas9 dans les cellules est essentielle pour les thérapies basées sur l’édition génétique. Les protocoles que nous montrons ici montrent une nouvelle approche dans cette direction. Le protocole utilise une nouvelle méthode d’électroporation appelée électroporation par tube.
Cela conduit à des taux élevés de survie cellulaire ainsi que des taux d’édition de gènes. La méthode d’électroporation du tube est sans virus, médicament et enrichissement du journaliste. Ceux-ci sont préférés dans les applications cliniques, ainsi avec des thérapies basées sur l’édition de gène.
La méthode est universellement applicable à de nombreux types de cellules. Par exemple, les cellules hématopoïétiques humaines, les cellules T primaires et d’autres cellules peuvent toutes être modifiées à l’aide de notre méthode. Cette méthode d’électroporation du tube utilise un tube mince.
Si vous êtes un utilisateur pour la première fois, vous pouvez essayer GFP exprimant l’ADN plasmide. La démonstration de la procédure sera Linyuan Ma, un postdoc de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure acquérir iPSCs humains de l’American Type Culture Collection.
Culture des iPSCs sur matrice extracellulaire artificielle avec milieu de culture cellulaire sans mangeoire dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone suivant les instructions du fournisseur. Deux heures avant la transfection traiter les iPSCs avec 10 micromolaire Rho-associé bobine bobine contenant inhibiteur de la kinase protéique Y-27632. Lors de la transfectation, dissocier les IPSC avec la solution de détachement cellulaire à des cellules individuelles à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Comptez ensuite le nombre de cellules. Pour établir une culture cellulaire fibroblaste de lapin obtenir une biopsie de peau d’oreille de la pointe d’une oreille de lapin. Rincez le tissu deux fois avec du DPBS contenant 5% de pénicilline-streptomycine.
Transférer le tissu auditif rincé dans un nouveau plat de culture tissulaire de six centimètres et couper le tissu en petits morceaux, chacun environ un par un millimètre. Ajouter quelques gouttes de FBS pour empêcher le tissu de se dessécher. Après cela, étendre le tissu déchiqueté dans un plat de culture tissulaire de 10 centimètres et ajouter 10 millilitres de milieu de culture.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois à cinq jours. Trois à cinq jours après l’utilisation du placage Trypsin-EDTA pour digérer les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, puis compter le nombre de cellules. Après avoir conçu et synthétisé les ARN et les oligos donneurs, préparez les cellules comme décrit précédemment.
Resuspendez 20 à 30 000 cellules dans 20 microlitres de tampon d’électroporation. Pipette de haut en bas soigneusement pour produire une suspension à cellule unique. Pour la transfection cas9 RNP, pré-mélanger deux microgrammes de protéine Cas9 NLS avec 0,67 microgramme d’ARN g À température ambiante pendant 10 à 15 minutes.
Mélanger délicatement le complexe RNP formé avec deux microgrammes de ssODN avec des cellules. À l’aide de pointes de pipette universelles provenant du kit d’électroporation, transférer le mélange cellulaire dans un tube d’électroporation de 20 microlitres. Placez le tube d’électroporation dans la fente de l’électroporateur et appuyez sur aller pour finir.
Un cycle d’électroporation réussi est indiqué par le rapport d’impulsion sur l’écran d’affichage de l’électroporateur. Après le transfert d’électroporation les cellules humaines d’iPS à un millilitre de Y-27632 préchauffé contenant le milieu de culture comme précédemment décrit. Ensuite, plaquez les cellules résuspendées dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits.
Continuez à faire la culture de l’assiette, en vous assurant de changer le milieu culturel tous les jours. Y-27632 est retiré du milieu de culture iPSC humain 24 heures après électroporation. 72 heures après l’électroporation, récolter les cellules.
Pour les cellules fibroblastes de lapin, utilisez trypsine-EDTA pour digérer les cellules de la plaque de culture. Pour les iPSCs humains utilisent la solution de détachement cellulaire pour digérer les cellules des plaques de culture. Centrifugez brièvement les échantillons à 1000 rpm pendant cinq minutes, et résuspendez les cellules avec 350 millilitres de tampon de lyse.
Incuber toute la nuit à 55 degrés Celsius. Le lendemain extraire l’ADN génomique avec du phénol-chloroforme en utilisant des procédures standard. Amplifiez 100 à 200 paires de bases de fragments d’ADN à partir de gels à l’aide d’un kit d’extraction de gel ou directement à partir de produits PCR à l’aide d’un mini kit PCR SV.
Pour déterminer l’efficacité de l’édition génétique par séquençage des colonies bactériennes, utilisez un kit de clonage TOPO-TA pour classer les produits PCR purifiés en un vecteur PCR4-TOPO. Ramassez aléatoirement les clones bactériens et séquencez les inserts à l’aide d’une amorce de séquençage universelle fournie par le kit de clonage TOPO-TA. Pour déterminer l’efficacité de l’édition génétique par séquençage profond, envoyez les produits PCR purifiés précédemment obtenus pour le séquençage amplicon CRISPR dans un noyau de séquençage de l’ADN.
Dans cette étude, une méthode d’électroporation par tube est effectivement utilisée pour fournir crispr/Cas9 RNP et ssODNs aux lapins et aux cellules humaines, conduisant à un montage génétique robuste et précis. Tout d’abord, les mutations C231Y et Q235X sont produites dans le gène IL2RG, et la mutation R150G est produite dans le gène SPR dans les cellules fibroblastes de lapin. Les conceptions spécifiques de sgRNA et les taux d’édition de gène déterminés par le clonage bactérien de TA sont montrés ici.
Le locus IL2RG C231, sur les 28 clones séquencés, l’un porte la mutation C231Y précise, quatre portent des mutations d’insertion ou de suppression, et les 23 autres sont de type sauvage. Au locus IL2RG Q235, sur les 27 clones séquencés, deux portent la mutation Q235X précise, trois portent une mutation indélébile, et les autres sont de type sauvage. Au locus SPG R150, sur les 20 clones séquencés, cinq portent la mutation précise du gène R150, 10 portent des mutations indélébiles, et les autres sont de type sauvage.
L’électroporation par tube est ensuite utilisée pour livrer le RNP cas9 et les ssODNs aux iPSCs humains et cibler des loci cliniquement pertinents dans les gènes EGFR, Mybpc3 et HBB. Au locus EGFR, 15,68% des allèles portent les mutations ponctuelles précises, 22,75% portent des mutations indélébiles, et les 61,57% restants sont de type sauvage. Au locus Mybpc3, 37,92% portent la suppression précise de quatre paires de base TGAA, 2,24% portent des mutations indélébiles, et les 59,84% restants sont de type sauvage.
Au locus HBB, 11,5 % sont porteurs de la mutation précise de l’E6V, 35,4 % sont porteurs de mutations indélébiles et les 65 % restants sont de type sauvage. Cas9 RNP est la forme préférée de Cas9 en raison de sa plus petite taille par rapport à l’ADN plasmide. L’électroporation du tube est une méthode efficace pour fournir cas9 RNP.
Nous sommes particulièrement intéressés à utiliser l’électroporation par tube de Cas9 RNP dans les cellules T primaires pour les applications CAR T.
