Fornire in modo sicuro ed efficace elementi Cas9 nelle cellule è fondamentale per le terapie basate sull'editing genico. I protocolli che mostriamo qui mostrano un nuovo approccio in quella direzione. Il protocollo utilizza un nuovo metodo di elettroporazione chiamato elettroporazione del tubo.
Ciò porta ad alti tassi di sopravvivenza cellulare e tassi di editing genico. Il metodo di elettroporazione del tubo è virus, farmaco e l'arricchimento del reporter libero. Questi sono preferiti nelle applicazioni cliniche, quindi con le terapie basate sull'editing genico.
Il metodo è universalmente applicabile a molti tipi di cella. Ad esempio, le cellule ematopoietiche umane, le cellule T primarie e altre cellule possono essere modificate usando il nostro metodo. Questo metodo di elettroporazione del tubo utilizza un tubo sottile.
Se sei un utente per la prima volta, puoi provare GFP ad esprimere DNA plasmide. A dimostrare la procedura sarà Linyuan Ma, un postdoc del mio laboratorio. Per avviare questa procedura acquisire iPSC umani dalla American Type Culture Collection.
Coltura gli iPSC su matrice extracellulare artificiale con mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica seguendo le istruzioni del fornitore. Due ore prima della trasfezione trattare gli iPSC con bobina arrotolato associata a Rho micromolare contenente inibitore della protein chinasi Y-27632. Durante la trasfettazione, dissociare gli iPSC con la soluzione di distacco cellulare a singole cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi contare il numero di celle. Per stabilire una coltura cellulare di fibroblasti di coniglio ottenere una biopsia della pelle dell'orecchio dalla punta di un orecchio di coniglio. Risciacquare il tessuto due volte con DPBS contenente il 5%di penicillina-streptomicina.
Trasferire il tessuto dell'orecchio risciacquato in un nuovo piatto di coltura tissutale di sei centimetri e tagliare il tessuto a piccoli pezzi, ognuno di circa uno per un millimetro. Aggiungere alcune gocce di FBS per evitare che il tessuto si asciughi. Dopo questo, stendere il tessuto triturato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per tre o cinque giorni. Da tre a cinque giorni dopo la placcatura utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per due minuti, quindi contare il numero di celle. Dopo aver progettato e sintetizzato i gRNA e gli oligo donatori, preparare le cellule come descritto in precedenza.
Rimescolare da 20 a 30.000 cellule in 20 microlitri di tampone di elettroporazione. Pipetta su e giù con cura per produrre una singola sospensione cellulare. Per la trasfezione Cas9 RNP, pre-mescolare due microgrammi di proteina Cas9 NLS con 0,67 microgrammi di gRNA a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
Mescolare delicatamente il complesso RNP formato con due microgrammi di ssODN con le cellule. Utilizzando punte di pipetta universali dal kit di elettroporazione, trasferire la miscela cellulare in un tubo di elettroporazione a 20 microliter. Posizionare il tubo di elettroporazione nella fessura dell'elettroporatore e premere andare a finire.
Un ciclo di elettroporazione riuscito è indicato dal rapporto di impulso sullo schermo dell'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione trasferire le cellule iPS umane in un millilitro di Y-27632 pre-riscaldato contenente il mezzo di coltura come descritto in precedenza. Quindi placcare le cellule rimostrate in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 po '.
Continua a coltivare il piatto, assicurandoti di cambiare il mezzo di coltura ogni giorno. Y-27632 viene rimosso dal mezzo di coltura iPSC umano 24 ore dopo l'elettroporazione. 72 ore dopo l'elettroporazione, raccogliere le cellule.
Per le cellule fibroblatrici di coniglio, utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule dalla piastra di coltura. Per gli iPSC umani utilizzare la soluzione di distacco cellulare per digerire le cellule dalle piastre di coltura. Centrifugare brevemente i campioni a 1000 giri/min per cinque minuti e rimescolare le cellule con 350 millilitri di tampone dilisi.
Incubare durante la notte a 55 gradi Celsius. Il giorno dopo estrarre il DNA genomico con fenolo-cloroformio utilizzando procedure standard. Amplifica da 100 a 200 basi coppie di frammenti di DNA provenienti da gel utilizzando un kit di estrazione del gel o direttamente da prodotti PCR utilizzando un mini kit PCR SV.
Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento delle colonie batteriche, utilizzare un kit di clonazione TOPO-TA per ligare i prodotti PCR purificati in un vettore PCR4-TOPO. Raccogli casualmente cloni batterici e sequenzia gli inserti utilizzando un primer di sequenziamento universale fornito dal kit di clonazione TOPO-TA. Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento profondo, inviare i prodotti PCR purificati precedentemente ottenuti per il sequenziamento dell'amplicon CRISPR in un nucleo di sequenziamento del DNA.
In questo studio viene utilizzato efficacemente un metodo di elettroporazione del tubo per fornire CRISPR/Cas9 RNP e ssODN a cellule di coniglio e umane, portando a un editing genico robusto e preciso. In primo luogo, le mutazioni C231Y e Q235X sono prodotte nel gene IL2RG, e la mutazione R150G è prodotta nel gene SPR nelle cellule fibroblasti di coniglio. I progetti specifici di sgRNA e i tassi di editing genico determinati dalla clonazione di TA batterica sono mostrati qui.
Il locus IL2RG C231, dei 28 cloni sequenziati, si porta la precisa mutazione C231Y, quattro portano mutazioni di inserimento o cancellazione, e i restanti 23 sono di tipo selvaggio. Al locus IL2RG Q235, dei 27 cloni sequenziati, due portano la precisa mutazione Q235X, tre portano una mutazione indelebile e gli altri sono di tipo selvaggio. Al locus SPG R150, dei 20 cloni sequenziati, cinque portano la precisa mutazione genica R150, 10 portano mutazioni indele, e gli altri sono di tipo selvaggio.
L'elettroporazione del tubo viene quindi utilizzata per fornire Cas9 RNP e ssODN agli iPSC umani e indirizzare loci clinicamente rilevanti nei geni EGFR, Mybpc3 e HBB. Al locus EGFR, il 15,68% degli alleli porta le mutazioni puntili precise, il 22,75% porta mutazioni indeli e il restante 61,57% è di tipo selvaggio. Al locus Mybpc3, il 37,92% porta la precisa cancellazione TGAA a quattro coppie di basi, il 2,24% porta mutazioni indele e il restante 59,84% è di tipo selvaggio.
Al locus HBB, l'11,5% porta la mutazione E6V precisa, il 35,4% porta mutazioni indele e il restante 65% è di tipo selvatico. Cas9 RNP è la forma preferita di Cas9 a causa delle sue dimensioni più piccole rispetto al DNA plasmide. L'elettroporazione del tubo è un metodo efficace per fornire Cas9 RNP.
Siamo particolarmente interessati all'utilizzo dell'elettroporazione del tubo di Cas9 RNP nelle celle T primarie per applicazioni CAR T.
