يمكن أن يكون بروتوكولنا بمثابة دليل عام لإنشاء نماذج الماوس المعاد تشكيلها مع PBMC البشرية والأورام لأبحاث الأورام المناعية. توفر هذه الإجراءات نهجًا فعالًا من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ للغاية لإعادة تكوين المناعة البشرية جزئيًا في الفئران الحاملة للورم البشري من خلال الخلايا تحت الجلد وخلط PBMC البشري مع xenografts السرطان. إظهار الإجراءات معي سيكون شينشين كوي، يانخوان تشانغ، هويشن باي وشيالونغ يانغ، أرسلت لنا من قسم الصيدلة.
لاستنفاد الخلايا النخاعية داخل peritoneally تسليم 100mg لكل كيلوغرام من السيكلوفوسفامي وتسليم شفويا 125mg لكل كيلوغرام من disulfiram إلى ستة إلى ثمانية أسابيع الفئران الإناث NOD / SCID مرة واحدة في اليوم لمدة يومين. بعد 24 ساعة من الجرعة الثانية من السيكلوفوسفامي و ديسولفيريم، resuspend خمس مرات 10 من ستة معزولة حديثا PBMC الإنسان و 2.5 مرات 10 من خلايا خط الخلايا السرطانية البشرية الست و 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 50٪ metrogel لكل وحقن كامل حجم تحت الجلد في الجناح الأيمن لكل تجريبي. قياس وتسجيل حجم الورم الأساسي مرتين في الأسبوع لمدة أربعة إلى ستة أسابيع.
عندما تصل الأورام إلى حجم متوسط من 200 إلى 500 ملليمتر مكعبة ، استخدم مقص optomic لحصاد الورم بأكمله من كل. PBMC المانحين خطوط الخلايا السرطانية ومريض مشتق xenografts التي تؤدي إلى نمو متوسط الورم مع ارتفاع نسبيا PD-1، PD-L1 و CD8 التعبير ينبغي أن تستخدم لتحليل لاحق. للتحليل المناعي الكيميائي للأنسجة الورم المحصودة، قم بإصلاح العينات و 24 إلى 72 ساعة قبل الجفاف وتضمين الأنسجة في البارافين.
الحصول على ثلاثة أقسام ميكرومتر من الأنسجة جزءا لا يتجزأ على الشرائح المغلفة polylysine و deparaffinize العينات مع ثلاثة سبع دقائق الغمر إكسيلين. بعد العلاج الثالث ، هيدرات المقاطع مع ثلاث دقائق متدرج الكحول الغمر. ثم شطف الشريحة في الماء الأيونية ثلاث مرات وإزالة أي سائل الزائدة من الشرائح.
لتنفيذ استرداد antigen، ضع الشرائح في حاوية وتغطية الشرائح بمخزن مؤقت sodiocitrate 10 ملليمولار. سخني الشرائح، الحاويات، في ميكروويف لمدة ثلاث دقائق قبل وضع الشرائح في حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، شطف الشرائح ثلاث مرات في المياه غير المؤينة وpirate أي السائل الزائد من الشرائح.
احتضان مع 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق لمنع نشاط البيروكسيديز الذاتية تليها عرقلة مع 3٪ BSA وBBS لمدة ساعة واحدة. في نهاية حضانة بيروكسيد الهيدروجين، تسمية الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، علاج الشرائح مع بيروكسيديز الفجل مترافق الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل تطبيق الركيزة قطرة على الشرائح حتى يتم ملاحظة مستوى مناسب من تلطيخ البني عن طريق المجهر الخفيفة.
بعد ذلك، وصمة عار العينات مع الهماوكسيلين. بعد دقيقة واحدة، ووقف رد فعل مع الماء المقطر تليها الغمر خمس ثوان في 0.5٪ حمض الهيدروكلوريك الكحول وخمس ثوان في 0.5٪ ماء الأمونيا. ثم يجفف العينات مع ثلاثة تصاعدي ثلاثة ايثانول دقيقة وثلاثة، خمس دقائق الزج إكسيلين.
لتقييم نشاط مضاد الديوم من دواء المرشح من الفائدة، وبدء العلاج في يوم تلقيح الخلايا وفقا للبروتوكول التجريبي المخطط ورصد حجم الورم الأساسي مرتين في الأسبوع لمدة أربعة إلى ستة أسابيع. بالنسبة للتحليل الديناميكي للورم تسللت الخلايا المناعية، فرم أنسجة الورم إلى قطع صغيرة وهضم الشظايا مع الكولاجيناز من نوع واحد وDNase I و RPMI-1640 المتوسطة بالإضافة إلى 5٪ FBS لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية عملية الهضم، تصفية الأنسجة المهضوضة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على تعليق خلية واحدة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه في مرة واحدة 10 من الخلايا السابعة لكل ملليلتر من الجليد الباردة فاكس تركيز العازلة ونقل حجم متساو من الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة أسفل جولة 96 جيدا. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من IGG الإنسان لمدة 30 دقيقة لمنع أي ملزمة غير محددة. ثم وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية قبل تحليلها عن طريق تدفق الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية.
كما هو موضح، 100 ملليغرام لكل كيلوغرام سيكلوفوسفاميميد و 125 ملليغرام لكل كيلوغرام الاستئصال النميلي disulfiram يؤدي إلى استنفاد كبير من العدلات والموحدات أربعة أيام بعد العلاج. بعد PBMC البشرية وزرع الورم، يمكن التحقق من وجود الخلايا المناعية البشرية تسلل داخل البيئة الدقيقة الورم بواسطة الكيمياء المناعية. ويمكن إجراء فحص في الجسم الحي من فريق من المتبرعين PBMC لتأكيد وجود تسرب عالي نسبيا من الخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم في معدل نمو الورم مقبولة.
يمكن أيضًا تقييم خطوط الخلايا السرطانية البشرية في xenografts المشتقة من أنواع مختلفة من السرطان لتقييم معدل نمو الورم وتسلل الخلايا المناعية. في هذه التجربة التمثيلية، أدى علاج PBMC والفئران المطعمة المطعّمة مع الأجسام المضادة PD1 الأنسانية إلى أنشطة مضادة للورم. ديسولفيريرام يقلل من السمية urotoxicity من cyclophosphamide, قد التركيبة ممارسة آثار العدلات أطول أمدا في الفئران.
قد تحتاج الجرعات الدقيقة من السيكلوفوسفامي و disulfiram إلى أن تكون محددة مسبقا. وقد أنشئت سلالات أحدث من الفئران أكثر المناعة الأسهل إعادة تشكيل الحصانة البشرية وانخفاض تأثير GvHD xenogenic وهي في انتظار مزيد من التحقيقات مع بروتوكولنا الموثق. نموذجنا مفيد لتقييم الخلايا التى إشراك العلاجات المناعية السرطانية، خاصة عند العمل على جداول زمنية قصيرة أو لاختيار العوامل قبل الانتقال إلى نموذج مناعة متعدد خطوط أكثر تعقيدا.
