우리의 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 PBMC 및 종양으로 재구성된 마우스 모형을 설치하기 위한 일반적인 지침역할을 할 수 있습니다. 이 절차는 인간 적인 종양 을 베어링 마우스에 있는 인간 면역을 부분적으로 재구성하고 암 이체와 인간 PBMC의 혼합을 위한 비용 효과적이고 높게 재현가능한 접근을 제공합니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 신신 쿠이, 얀후안 장, 휘첸 바이, 샤오롱 양이 약리학과에서 우리를 보내게 될 것입니다.
골수성 세포 고갈의 경우 복막시 시클로포스파미드의 킬로그램당 100mg을 전달하고 구두로 2일 동안 하루에 한 번 NOD/SCID 암컷 마우스를 6~8주 에 디설피람킬로그램당 125mg을 전달한다. 사이클로포스파미드와 디설피람의 두 번째 투여량 후 24시간 후, 갓 고립된 6개의 인간 PBMC 중 5배, 인간 종양 세포세포 6개 중 2.5배, PBS 200마이크로리터+ 동물1인당 50%의 메트로겔을 동물 실험의 오른쪽 측면에 피하한다. 4~6주 동안 일주일에 두 번 1차 종양 부피를 측정하고 기록한다.
종양이 200 에서 500 밀리미터 의 평균 부피에 도달하면, 각 동물에서 전체 종양을 수확하기 위해 검안 가위를 사용합니다. PBMC 기증자 종양 세포주 및 상대적으로 높은 PD-1, PD-L1 및 CD8 발현을 가진 온건한 종양 성장을 초래하는 환자 유래 이종이이식은 후속 분석을 위해 이용되어야 한다. 수확된 종양 조직의 면역 조직 화학적 분석을 위해, 파라핀에 있는 조직의 탈수 및 포함 전에 24 72 시간 전에 견본 및 포르말린을 고칠 수 있습니다.
폴리리신 코팅 슬라이드에 내장 된 조직의 세 마이크로 미터 섹션을 얻고 3 7 분 자일렌 몰입으로 샘플을 분리하십시오. 세 번째 치료 후 3 분 등급 알코올 침전으로 섹션을 수화합니다. 그런 다음 슬라이드를 탈온 된 물에 세 번 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 제거합니다.
항원 검색을 수행하려면 슬라이드를 용기에 넣고 슬라이드를 10 밀리미터 소디오이트 버퍼로 덮습니다. 슬라이드, 컨테이너를 전자레인지에 넣고 3분간 가열한 후 슬라이드를 섭씨 95도의 수조에 30분간 놓습니다. 실온으로 냉각한 후 슬라이드를 탈온된 물에 세 번 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 흡인시합니다.
10분 동안 0.3%의 과산화수소로 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 차단한 다음 1시간 동안 3%BSA 및 PBS로 차단합니다. 과산화수소 배양의 끝에서, 하룻밤 4섭씨에서 적절한 1 차 항체로 슬라이드를 라벨. 다음날 아침, 고추냉이 과산화제 접합이 부추형 항체로 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 처리한 후 가벼운 현미경검사법에 의해 적절한 수준의 갈색 염색이 관찰될 때까지 슬라이드에 기판을 드롭와이즈로 적용한다.
다음으로, 헤마톡슬린으로 샘플을 얼룩지게 합니다. 1분 후 증류수와의 반응을 멈추고 0.5%의 염산 알코올로 5초, 암모니아 물 0.5%로 5초 가시화됩니다. 그런 다음 3분 에탄올 3분, 자일렌 3분, 5분 짜리 자일렌 침수로 샘플을 탈수합니다.
관심 있는 약물의 항종양 활성을 평가하기 위하여는, 계획된 실험 프로토콜에 따라 세포 접종의 날에 처리를 시작하고 4 6 주 동안 주 2회 1 차 종양 부피를 감시합니다. 약청에 침투된 면역 세포의 PharmaCODE 동적 분석을 위해 종양 조직을 작은 조각으로 잘라내고 콜라게나아제 타입 1과 DNase I 및 RPMI-1640 배지와 5%FBS를 섭씨 37도에서 30분 동안 소화합니다. 소화의 끝에서, 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 필터링하여 단일 세포 현탁액을 얻고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
얼음 차가운 팩스 버퍼 농도의 밀리리터 당 일곱 번째 세포의 1회 10번에서 펠릿을 재연하고 96웰 라운드 하단 플레이트에서 적절한 수의 우물로 동일한 양의 세포를 이송한다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 어떤 비특이적 결합을 차단하기 위해 30 분 동안 인간 IGG의 밀리리터 당 20 마이크로 그램에서 펠릿을 재중단. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 분석하기 전에 섭씨 4도에서 30분 동안 적절한 1차 항체로 세포를 얼룩지게 한다.
입증 된 바와 같이, 킬로그램 사이클로포스파미드 당 100 밀리그램과 킬로그램 당 125 밀리그램 디설피람 골수 절제술은 호중구와 단핵구의 상당한 고갈을 초래한다 4 일 후 치료. 인간 PBMC 및 종양 이식 후, 면역 세포 침투의 존재는 면역 조직 화학에 의해 종양 미세 환경 내에서 확인할 수 있습니다. PBMC 기증자의 패널의 생체 내 스크리닝은 수용 가능한 종양 성장 율에서 종양 미세 환경으로 상대적으로 높은 면역 세포 침투의 존재를 확인하기 위해 수행 될 수있다.
상이한 암 유형의 환자 유래 xenografts에서 인간 암 세포라인은 또한 종양 성장 속도 및 면역 세포 침투를 평가하기 위하여 평가될 수 있다. 본 대표적인 실험에서, 인간화된 항PD1 항체를 가진 PBMC 와 접목된 인간화된 마우스의 치료는 상당한 항종양 활동을 초래하였다. 디술피람은 사이클로포스파미드의 비뇨기독성을 감소시며, 이 조합은 마우스에서 더 오래 지속되는 호중구 감소니아 효과를 발휘할 수 있다.
사이클로포스파미드와 디술피람의 정확한 투여량 요법은 미리 결정될 필요가 있다. 인간 면역 재구성과 감소된 외국인 성 GvHD 효과를 위한 면역 결핍마우스의 새로운 변종이 확립되었으며 문서화된 프로토콜로 추가 조사를 보류중입니다. 우리의 모형은 T 세포 가관여하는 암 면역 치료를 평가하는 데 유용합니다, 특히 짧은 타임 라인에서 작업하거나 더 복잡한 다중 리니지 면역 모델로 이동하기 전에 에이전트를 선택하는 데 유용합니다.
