Unser Protokoll kann als allgemeine Richtlinie für die Erstellung von Mausmodellen dienen, die mit humanem PBMC und Tumoren für die Immunonkologieforschung rekonstituiert wurden. Diese Verfahren bieten einen kostengünstigen und hochreproduzierbaren Ansatz zur teilweisen Wiederherstellung der menschlichen Immunität bei tumortragenden Mäusen durch subkutane und Vermischung von humanem PBMC mit Krebs-Xenografts. Mit mir werden Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai und Xiaolong Yang die Verfahren demonstrieren, die uns von der Pharmakologie-Abteilung geschickt haben.
Für myeloische Zellerschöpfung intra peritoneally liefern 100mg pro Kilogramm Cyclophosphamid und oral liefern 125mg pro Kilogramm Disulfiram zu sechs bis acht Wochen alten NOD / SCID weiblichen Mäusen einmal täglich für zwei Tage. 24 Stunden nach der zweiten Dosis von Cyclophosphamid und Disulfiram fünfmal 10 der sechs frisch isolierten menschlichen PBMC und 2,5 mal 10 der sechs menschlichen Tumorzelllinienzellen und 200 Mikroliter PBS plus 50% Metrogel pro Tier resuspendieren und das gesamte Volumen subkutan in die rechte Flanke jedes Versuchstiers injizieren. Messen und erfassen Sie das primäre Tumorvolumen zwei Mal pro Woche für vier bis sechs Wochen.
Wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von 200 bis 500 Millimetergewürfelt erreichen, verwenden Sie optomimischschere, um ganzen Tumor von jedem Tier zu ernten. PBMC-Spender Tumorzelllinien und patientenabgeleitete Xenografts, die zu einem moderaten Tumorwachstum mit relativ hoher PD-1-, PD-L1- und CD8-Expression führen, sollten für die nachfolgende Analyse verwendet werden. Für die immunhistochemische Analyse des geernteten Tumorgewebes, fixieren Sie die Proben und Formalin 24 bis 72 Stunden vor der Dehydrierung und Einbettung des Gewebes in Paraffin.
Erhalten Sie drei Mikrometerabschnitte des eingebetteten Gewebes auf polylysinbeschichteten Dias und deparaffinisieren Sie die Proben mit drei siebenminütigen Xylol-Tauchionen. Nach der dritten Behandlung hydratisieren Sie die Abschnitte mit drei minütigen abgestuften Alkoholeintauchen. Dann spülen Sie die Rutsche in entionisiertem Wasser dreimal und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Rutschen.
Um den Antigenabruf durchzuführen, legen Sie die Dias in einen Behälter und decken Sie die Dias mit einem 10 Millimolar-Sodiocitratpuffer ab. Erhitzen Sie die Rutschen, Behälter, in einer Mikrowelle für drei Minuten, bevor Sie die Dias in einem 95 Grad Celsius Wasserbad für 30 Minuten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur spülen Sie die Dias dreimal in entionisiertem Wasser ab und saugen überschüssige Flüssigkeit aus den Dias ab.
Mit 0,3% Wasserstoffperoxid für 10 Minuten inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, gefolgt von einer Blockierung mit 3%BSA und PBS für eine Stunde. Am Ende der Wasserstoffperoxid-Inkubation die Dias über Nacht mit den entsprechenden Primärantikörpern bei vier Grad Celsius beschriften. Am nächsten Morgen behandeln Sie die Dias mit Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie das Substrat tropfenweise auf die Dias auftragen, bis ein angemessenes Maß an brauner Färbung durch Lichtmikroskopie beobachtet wird.
Als nächstes färben Sie die Proben mit Hämatoxylin. Nach einer Minute, stoppen Sie die Reaktion mit destilliertem Wasser gefolgt von einem fünf Sekunden Untertauchen in 0,5%Salzsäure-Alkohol und fünf Sekunden in 0,5% Ammoniakwasser. Dann dehydrieren Sie die Proben mit drei aufsteigenden drei Minuten Ethanol und drei, fünf Minuten Xylol-Tauchsion.
Um die Antitumoraktivität eines Kandidatenmedikaments von Interesse zu bewerten, initiieren Sie die Behandlung am Tag der Zellimpfung gemäß dem geplanten experimentellen Protokoll und überwachen Sie das primäre Tumorvolumen zweimal pro Woche für vier bis sechs Wochen. Für die dynamische PharmaCODE-Analyse des Tumors infiltrierte Immunzellen, zerkleinern Sie das Tumorgewebe in kleine Stücke und verdauen Sie die Fragmente mit Kollagenase Typ eins und DNase I und RPMI-1640 medium plus 5%FBS für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie am Ende der Verdauung das verdaute Gewebe durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln.
Setzen Sie das Pellet bei einem Mal 10 der siebten Zellen pro Milliliter eiskalter Faxpufferkonzentration aus und übertragen Sie ein gleiches Zellvolumen auf die entsprechende Anzahl von Brunnen in einer 96-well runden Bodenplatte. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 20 Mikrogramm pro Milliliter menschlicher IGG für 30 Minuten, um jede unspezifische Bindung zu blockieren. Dann färben Sie die Zellen mit den entsprechenden primärantikörpern für 30 Minuten bei vier Grad Celsius vor ihrer Analyse durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen.
Wie gezeigt, 100 Milligramm pro Kilogramm Cyclophosphamid und 125 Milligramm pro Kilogramm Disulfiram Myeloablation führt zu einer signifikanten Erschöpfung der Neutrophilen und Monozyten vier Tage nach der Behandlung. Nach der menschlichen PBMC- und Tumortransplantation kann das Vorhandensein von infiltrierten menschlichen Immunzellen innerhalb der Tumormikroumgebung durch Immunhistochemie überprüft werden. Ein In-vivo-Screening eines Panels von PBMC-Spendern kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein einer relativ hohen Immunzellinfiltration in die Tumormikroumgebung in einer akzeptablen Tumorwachstumsrate zu bestätigen.
Menschliche Krebszelllinien bei Patienten abgeleitetxenografts verschiedener Krebsarten können auch bewertet werden, um die Tumorwachstumsrate und Dieinfiltration von Immunzellen zu bewerten. In diesem repräsentativen Experiment führte die Behandlung der PBMC und veredelte humanisierte Mäuse mit humanisiertem Anti-PD1-Antikörper zu signifikanten Antitumoraktivitäten. Disulfiram verringert die Urotoxizität von Cyclophosphamid, die Kombination kann länger anhaltende Neutropenie-Effekte bei Mäusen ausüben.
Die genaue Dosis von Cyclophosphamid und Disulfiram muss möglicherweise vorbestimmt werden. Neuere Stämme von immundefizienten Mäusen zur leichteren Rekonstitution der menschlichen Immunität und verminderter xenogener GvHD-Wirkung wurden festgestellt und warten weitere Untersuchungen mit unserem dokumentierten Protokoll an. Unser Modell ist nützlich für die Bewertung von T-Zell-ansprechenden Krebsimmuntherapien, insbesondere bei der Arbeit an kurzen Zeitplänen oder bei der Auswahl von Wirkstoffen, bevor sie zu einem komplexeren Multilineage-Immunitätsmodell übergehen.
