我々のプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためにヒトPBMCおよび腫瘍で再構成されたマウスモデルを確立するための一般的なガイドラインとして役立つ。これらの手順は、ヒトPBMCと癌異種移植片の皮下および混合を通じて、ヒト腫瘍を持つマウスにおけるヒト免疫を部分的に再構成するための費用対効果が高く、非常に再現性の高いアプローチを提供する。私と一緒に手順を示すのは、薬理科から私たちを送った新新樹クイ、ヤンフアン・ザン、ホイヘン・バイ、シャオロン・ヤンです。
骨髄細胞枯渇の腹腔内は1キログラム当たり100mgのシクロホスファミドを送達し、1キログラム当たり125mgのジスルフィラムを1日1回から8週齢のNOD/SCID雌マウスに2日間経口で送達する。シクロホスファミドとジスルフィラムの2回目の投与の2回目の投与の24時間後、6つの新たに単離されたヒトPBMCのうち5倍の10倍、6つのヒト腫瘍細胞株細胞のうち2.5倍、PBSの200マイクロリットルに加えて、動物1匹あたり50%のメトロゲルを再懸濁し、各実験動物の右脇腹に全容を皮下注射する。週に2回、4~6週間、原発性腫瘍量を測定し、記録する。
腫瘍が200〜500ミリメートルの平均体積に達すると、各動物から腫瘍全体を収穫するために検眼ハサミを使用する。PBMCドナーは、腫瘍細胞株および患者由来の異種移植片を移植し、その結果、比較的高いPD−1、PD-L1およびCD8発現を有する中程度の腫瘍増殖を生じ、その後の分析に使用すべきである。採取した腫瘍組織の免疫組織化学的分析のために、パラフィン中の組織の脱水および埋め込み前に、サンプルとホルマリンを24〜72時間固定する。
ポリリジンコーティングスライド上の埋め込み組織の3マイクロメーターセクションを取得し、3つの7分間のキシレン浸漬でサンプルを脱パラフィン化します。3回目の治療の後、3分間のグレードアルコール浸漬でセクションを水分補給します。その後、脱イオン水でスライドを3回すすぎ、余分な液体をスライドから取り除きます。
抗原の検索を行うには、スライドを容器に入れ、スライドを10ミリモルのソドクレートバッファーで覆います。スライドを電子レンジで3分間加熱してから、スライドを摂氏95度の水浴に30分間入れます。室温まで冷却した後、脱イオン水でスライドを3回洗い流し、スライドから余分な液体を吸引します。
0.3%過酸化水素を10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断し、続いて3%BSAおよびPBSで1時間遮断する。過酸化水素インキュベーションの終わりに、一晩で摂氏4度で適切な一次抗体でスライドにラベルを付けます。翌朝、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を室温で1時間処理してから、適切なレベルの褐色染色が光顕微鏡で観察されるまで、基板をスライドに滴下して塗布する。
次に、ヘマトキシリンでサンプルを染色する。1分後、蒸留水で反応を停止し、続いて0.5%塩酸アルコールで5秒の水没を、0.5%アンモニア水で5秒間浸水します。その後、3つの上昇3分エタノールと3、5分のキシレン浸漬でサンプルを脱水します。
対象となる薬剤の抗腫瘍活性を評価するには、計画された実験プロトコルに従って細胞接種の日に治療を開始し、週に2回、4〜6週間の原発腫瘍体積を監視する。腫瘍浸潤免疫細胞のPharmaCODE動的解析では、腫瘍組織を小片にミンチし、コラゲナーゼIとRPMI-1640培地+5%FBSで30°Cで30分間断片を消化します。消化の終了時に、消化した組織を40マイクロメートルの細胞ストレーナーで濾過し、単一細胞懸濁液を得て、遠心分離によって細胞を採取する。
ペレットを氷冷ファックスバッファ濃度のミリリットル当たり7番目の細胞の1倍に再懸濁し、96ウェルの丸い底板で同量の細胞を適切な数のウェルに移します。遠心分離によって細胞を収集し、任意の非特異的結合をブロックするために30分間、ヒトIGGのミリリットル当たり20マイクログラムでペレットを再懸濁します。次に、適切な一次抗体を摂氏4度で30分間染色してから、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーで分析します。
実証されているように、1キログラムのシクロホスファミドあたり100ミリグラム、ジスルフィラム骨髄化1キログラム当たり125ミリグラムは、治療後4日間に好中球および単球の大幅な枯渇をもたらす。ヒトPBMCおよび腫瘍移植後、ヒト免疫細胞浸潤の存在は、免疫組織化学によって腫瘍微小環境内で検証することができる。PBMCドナーのパネルのインビボスクリーニングを行い、許容可能な腫瘍増殖速度で腫瘍微小環境への比較的高い免疫細胞浸潤の存在を確認することができる。
異なる癌タイプの患者由来異種移植片におけるヒト癌細胞株も、腫瘍増殖率および免疫細胞浸潤を評価するために評価することができる。本代表的実験では、ヒト化抗PD1抗体を用いたPBMCおよび移植されたヒト化マウスの治療は、有意な抗腫瘍作用をもたらした。ジスルフィラムはシクロホスファミドの尿中毒性を低下させ、この組み合わせはマウスにおいてより長く持続性のある好中球減少作用を発揮し得る。
シクロホスファミドおよびジスルフィラムの正確な用量レジメンは、事前に決定する必要があるかもしれません。より免疫不全マウスの新しい株は、より簡単なヒト免疫再構成と異種GvHD効果の低下のために確立されており、我々の文書化されたプロトコルでさらなる調査を保留している。私たちのモデルは、T細胞の関与がん免疫療法を評価するのに役立ちます, 特に短いタイムラインに取り組むときや、より複雑な多系統免疫モデルに移動する前にエージェントを選択します.
