Nosso protocolo pode servir como uma diretriz geral para estabelecer modelos de camundongos reconstituídos com PBMC humano e tumores para pesquisa de imuno-oncologia. Esses procedimentos fornecem uma abordagem econômica e altamente reprodutível para a reconstituição parcial da imunidade humana em camundongos portadores de tumores humanos através de mistura subcutânea e mistura de PBMC humano com xenoenxertos de câncer. Demonstrando os procedimentos comigo estarão Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai e Xiaolong Yang, enviados do Departamento de Farmacologia.
Para o esgotamento das células mieloides intra peritoneally entregar 100mg por quilograma de ciclofosfame e entregar oralmente 125mg por quilograma de disulfiram a camundongos fêmeas NOD/SCID de seis a oito semanas de idade uma vez por dia durante dois dias. 24 horas após a segunda dose de ciclofosfameto e dissulfiram, resuspensa cinco vezes 10 dos seis PBMC humanos recém-isolados e 2,5 vezes 10 das seis células de células tumorais humanas e 200 microliters de PBS mais 50% metrogel por animal e injetar todo o volume subcutâneamente no flanco direito de cada animal experimental. Meça e regise o volume primário do tumor duas vezes por semana durante quatro a seis semanas.
Quando os tumores atingem um volume médio de 200 a 500 milímetros cubos, use tesouras otómicas para colher tumor inteiro de cada animal. Devem ser utilizadas linhas de células tumorais e xenoenxertos derivados do paciente que resultem em um crescimento tumoral moderado com expressão PD-1, PD-L1 e CD8 relativamente alta. Para análise imunohistoquímica dos tecidos tumorais colhidos, fixar as amostras e formalina 24 a 72 horas antes da desidratação e incorporação dos tecidos em parafina.
Obtenha três seções de micrômetros dos tecidos incorporados em lâminas revestidas de polilise e desparafinar as amostras com três imersões de xileno de sete minutos. Após o terceiro tratamento, hidrate as seções com imersões de álcool de três minutos. Em seguida, enxágue o slide em água desionizada três vezes e remova qualquer excesso de líquido dos slides.
Para realizar a recuperação de antígenos, coloque os slides em um recipiente e cubra os slides com um tampão de sodiocitrate de 10 milimões. Aqueça os slides, recipiente, em um micro-ondas por três minutos antes de colocar os slides em um banho de água de 95 graus Celsius por 30 minutos. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, enxágue os slides três vezes em água desionizada e aspire qualquer excesso de líquido dos slides.
Incubar com peróxido de hidrogênio de 0,3% por 10 minutos para bloquear a atividade peroxidase endógena seguida de bloqueio com 3%BSA e PBS por uma hora. No final da incubação de peróxido de hidrogênio, rotule os slides com os anticorpos primários apropriados a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, trate os slides com anticorpo secundário conjugado peroxidase de rabanete por uma hora à temperatura ambiente antes de aplicar o substrato dropwise nos slides até que um nível apropriado de coloração marrom seja observado por microscopia leve.
Em seguida, manche as amostras com hematoxilina. Após um minuto, pare a reação com água destilada seguida de uma submersão de cinco segundos em álcool ácido clorídrico de 0,5% e cinco segundos em 0,5% de água de amônia. Em seguida, desidratar as amostras com três etanol ascendentes de três minutos e três, cinco minutos de imersão em xileno.
Para avaliar a atividade antitumoral de uma droga de interesse candidata, inicie o tratamento no dia da inoculação celular de acordo com o protocolo experimental planejado e monitore o volume do tumor primário duas vezes por semana durante quatro a seis semanas. Para a análise dinâmica pharmaCODE das células imunes infiltradas do tumor, pique os tecidos tumorais em pequenos pedaços e digera os fragmentos com colagenase tipo um e DNase I e RPMI-1640 médio mais 5%FBS por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da digestão, filtre o tecido digerido através de um coador de células de 40 micrômetros para obter uma única suspensão celular e coletar as células por centrifugação.
Resuspenque a pelota em uma vez 10 das sete células por mililitro de concentração de buffer de fax frio gelado e transfira um volume igual de células para o número apropriado de poços em uma placa inferior redonda de 96 poços. Colete as células por centrifugação e resuspenja as pelotas em 20 microgramas por mililitro de IGG humano por 30 minutos para bloquear qualquer ligação inespecífica. Em seguida, colorigue as células com os anticorpos primários apropriados por 30 minutos a quatro graus Celsius antes de sua análise por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.
Como demonstrado, 100 miligramas por quilograma de ciclofosfamatto e 125 miligramas por quilograma de mieloablação dissulfiram resulta em um esgotamento significativo de neutrófilos e monócitos quatro dias após o tratamento. Após o PBMC humano e o transplante de tumores, a presença de infiltrados de células imunes humanas pode ser verificada dentro do microambiente tumoral por imunohistoquímica. Uma triagem in vivo de um painel de doadores de PBMC pode ser realizada para confirmar a presença de uma infiltração relativamente alta de células imunes no microambiente tumoral em uma taxa de crescimento tumoral aceitável.
Linhas de células cancerígenas humanas em xenoenxertos derivados de pacientes de diferentes tipos de câncer também podem ser avaliadas para avaliar a taxa de crescimento do tumor e a infiltração de células imunes. Neste experimento representativo, o tratamento do PBMC e camundongos humanizados enxertados com anticorpo anti-PD1 humanizado resultou em atividades antitumorais significativas. Disulfiram diminui a urotoxicidade do ciclofosfamatto, a combinação pode exercer efeitos de neutropenia mais duradouros em camundongos.
O regime de dose exata de ciclofosfamatida e dissulfiram pode precisar ser predeterminado. Novas cepas de camundongos mais imunodeficientes para a reconstituição mais fácil da imunidade humana e diminuição do efeito Xenógênico GvHD foram estabelecidas e estão pendentes de novas investigações com nosso protocolo documentado. Nosso modelo é útil para avaliar terapias imunológicas de câncer de células T, particularmente quando se trabalha em cronogramas curtos ou para selecionar agentes antes de se mudar para um modelo de imunidade multilineagem mais complexo.
