Notre protocole peut servir de ligne directrice générale pour l’établissement de modèles muraux reconstitués avec pbmc humain et tumeurs pour la recherche en immuno-oncologie. Ces procédures fournissent une approche rentable et hautement reproductible pour reconstituer partiellement l’immunité humaine chez les souris tumorales humaines par le biais de sous-cutanées et le mélange de PBMC humain avec des xénogreffes cancéreuses. La démonstration des procédures avec moi sera Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai et Xiaolong Yang, nous a envoyé du département de pharmacologie.
Pour l’épuisement des cellules myéloïdes intra péritonéally livrer 100mg par kilogramme de cyclophosphamide et livrer oralement 125mg par kilogramme de disulfiram à six à huit semaines nod / SCID souris femelles une fois par jour pendant deux jours. 24 heures après la deuxième dose de cyclophosphamide et de disulfiram, resuspendez cinq fois 10 des six PBMC humains fraîchement isolés et 2,5 fois 10 des six cellules cellulaires tumorales humaines et 200 microlitres de PBS plus 50% de métrogel par animal et injectez tout le volume sous-cutanément dans le flanc droit de chaque animal expérimental. Mesurez et enregistrez le volume primaire de tumeur deux fois par semaine pendant quatre à six semaines.
Lorsque les tumeurs atteignent un volume moyen de 200 à 500 millimètres en cubes, utilisez des ciseaux optomiques pour récolter la tumeur entière de chaque animal. Les lignées cellulaires tumorales des donneurs de PBMC et les xénogreffes dérivées du patient qui entraînent une croissance modérée de la tumeur avec une expression relativement élevée de PD-1, PD-L1 et CD8 devraient être utilisées pour une analyse ultérieure. Pour l’analyse immunohistochimique des tissus tumoraux récoltés, fixer les échantillons et la formaline 24 à 72 heures avant la déshydratation et l’intégration des tissus dans la paraffine.
Obtenez trois sections de micromètres des tissus incorporés sur des glissières enduites de polylysine et déparaffinez les échantillons avec trois immersions de xylène de sept minutes. Après le troisième traitement, hydratez les sections avec des immersions d’alcool classées de trois minutes. Rincez ensuite la lame à l’eau déionisée trois fois et retirez tout excès de liquide des glissières.
Pour effectuer la récupération d’antigènes, placez les glissières dans un récipient et couvrez les glissières d’un tampon de sodiocitrate de 10 millimolaires. Chauffer les toboggans, récipient, au micro-ondes pendant trois minutes avant de placer les toboggans dans un bain d’eau de 95 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après refroidissement à température ambiante, rincer les glissières trois fois à l’eau déionisée et aspirer tout excès de liquide des toboggans.
Incuber avec du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 10 minutes pour bloquer l’activité endogène de la peroxyde suivie d’un blocage avec 3 % de BSA et de PBS pendant une heure. À la fin de l’incubation du peroxyde d’hydrogène, étiquetez les diapositives avec les anticorps primaires appropriés à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, traitez les toboggans avec de l’anticorps secondaire conjugué au raifort pendant une heure à température ambiante avant d’appliquer le substrat dans le sens de la goutte sur les glissières jusqu’à ce qu’un niveau approprié de coloration brune soit observé par microscopie légère.
Ensuite, tacher les échantillons avec de l’hématoxyline. Après une minute, arrêter la réaction avec de l’eau distillée suivie d’une submersion de cinq secondes dans 0,5% d’alcool acide chlorhydrique et cinq secondes dans 0,5% d’eau ammoniac. Déshydratez ensuite les échantillons avec trois éthanol ascendants de trois minutes et trois immersions de xylène de cinq minutes.
Pour évaluer l’activité antitumorale d’un médicament candidat d’intérêt, commencer le traitement le jour de l’inoculation cellulaire selon le protocole expérimental prévu et surveiller le volume de tumeur primaire deux fois par semaine pendant quatre à six semaines. Pour l’analyse dynamique pharmacode de la tumeur infiltrée cellules immunitaires, hacher les tissus tumoraux en petits morceaux et digérer les fragments avec collagène type un et DNase I et RPMI-1640 moyen plus 5%FBS pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la digestion, filtrer le tissu digéré à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres pour obtenir une suspension cellulaire unique et recueillir les cellules par centrifugation.
Resuspendez la pastille à une fois 10 des septièmes cellules par millilitre de concentration tampon de fax glacé et transférez un volume égal de cellules au nombre approprié de puits dans une plaque inférieure ronde de 96 puits. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés en 20 microgrammes par millilitre d’IGG humain pendant 30 minutes pour bloquer toute liaison non spécifique. Puis tacher les cellules avec les anticorps primaires appropriés pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avant leur analyse par cytométrie de débit selon les protocoles standard.
Comme démontré, 100 milligrammes par kilogramme de cyclophosphamide et 125 milligrammes par kilogramme de myéloablation disulfiram entraîne un épuisement significatif des neutrophiles et des monocytes quatre jours après le traitement. Après la transplantation humaine de PBMC et de tumeur, la présence de cellules immunitaires humaines s’infiltre peut être vérifiée dans le microenvironnement de tumeur par immunohistochimie. Un criblage in vivo d’un panneau des donateurs de PBMC peut être exécuté pour confirmer la présence d’une infiltration immunisée relativement élevée de cellules dans le microenvironnement de tumeur dans un taux acceptable de croissance de tumeur.
Des lignées humaines de cellules cancéreuses dans les xénogreffes dérivées du patient de différents types de cancer peuvent également être évaluées pour évaluer le taux de croissance de tumeur et l’infiltration de cellules immunisées. Dans cette expérience représentative, le traitement du PBMC et des souris humanisées greffées avec l’anticorps humanisé d’anti-PD1 a eu comme conséquence des activités significatives d’antitumorat. Disulfiram diminue l’urotoxicité du cyclophosphamide, la combinaison peut exercer des effets de neutropénie plus durables chez les souris.
Le régime exact de dose de cyclophosphamide et de disulfiram peut devoir être prédéterminé. De nouvelles souches de souris plus immunodéficientes pour une reconstitution plus facile de l’immunité humaine et une diminution de l’effet xénogénique de GvHD ont été établies et sont en attente d’investigations plus approfondies avec notre protocole documenté. Notre modèle est utile pour évaluer les thérapies immunitaires contre le cancer à cellules T engageantes, en particulier lorsque vous travaillez sur des délais courts ou pour sélectionner des agents avant de passer à un modèle d’immunité multilimité plus complexe.
