Nuestro protocolo puede servir como una guía general para establecer modelos de ratón reconstituidos con PBMC humano y tumores para la investigación inmuno-oncológica. Estos procedimientos proporcionan un enfoque rentable y altamente reproducible para reconstituir parcialmente la inmunidad humana en ratones humanos portadores de tumores a través de PBMC humano y mezcla con xenoinjertos cancerosos. Demostrar los procedimientos conmigo será Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai y Xiaolong Yang, enviados desde el Departamento de Farmacología.
Para el agotamiento de células mieloides intra peritonealmente entregar 100mg por kilogramo de ciclofosfamida y entregar por vía oral 125mg por kilogramo de disulfiram a seis a ocho semanas de edad nod / SCID ratones hembra una vez al día durante dos días. 24 horas después de la segunda dosis de ciclofosfamida y disulfiram, resuspender cinco veces 10 de los seis PBMC humanos recién aislados y 2,5 veces 10 de las seis células de la línea celular tumoral humana y 200 microlitros de PBS más 50% metrogel por animal e inyectar todo el volumen por vía subcutánea en el flanco derecho de cada animal experimental. Mida y registre el volumen del tumor primario dos veces por semana durante cuatro a seis semanas.
Cuando los tumores alcancen un volumen promedio de 200 a 500 milímetros en cubos, utilice tijeras optómicas para cosechar un tumor entero de cada animal. Para su análisis posterior, se deben utilizar líneas celulares tumorales de donantes de PBMC y xenoinjertos derivados de pacientes que resulten en un crecimiento tumoral moderado con una expresión relativamente alta de PD-1, PD-L1 y CD8. Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos tumorales cosechados, fijar las muestras y formalina 24 a 72 horas antes de la deshidratación y la incrustación de los tejidos en la parafina.
Obtener tres secciones de micrómetros de los tejidos incrustados en diapositivas recubiertas de poli lisina y desparafinar las muestras con tres inmersiones de xileno de siete minutos. Después del tercer tratamiento, hidrata las secciones con inmersiones alcohólicas de tres minutos. A continuación, enjuague el portaobjetos en agua desionizada tres veces y retire el exceso de líquido de los portaobjetos.
Para realizar la recuperación de antígenos, coloque las diapositivas en un recipiente y cubra las diapositivas con un búfer de sodiocitrato de 10 milimolar. Calienta los portaobjetos, recipiente, en un microondas durante tres minutos antes de colocar los portaobjetos en un baño de agua de 95 grados Centígrados durante 30 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, enjuague los portaobjetos tres veces en agua desionizada y aspire cualquier exceso de líquido de los portaobjetos.
Incubar con 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 10 minutos para bloquear la actividad endógena de peroxidasa seguida de bloqueo con 3%BSA y PBS durante una hora. Al final de la incubación de peróxido de hidrógeno, etiquete los portaobjetos con los anticuerpos primarios apropiados a cuatro grados celsius durante la noche. A la mañana siguiente, tratar los portaobjetos con anticuerpo secundario conjugado de rábano peroxidasa picante durante una hora a temperatura ambiente antes de aplicar el sustrato en los portaobjetos hasta que se observe un nivel adecuado de tinción marrón mediante una microscopía ligera.
A continuación, manche las muestras con hematoxilina. Después de un minuto, detenga la reacción con agua destilada seguida de una inmersión de cinco segundos en 0,5% de alcohol ácido clorhídrico y cinco segundos en 0,5% de agua de amoníaco. Luego deshidratar las muestras con tres ascendentes de tres minutos de etanol y tres, cinco minutos de inmersión en xileno.
Para evaluar la actividad antitumote de un medicamento candidato de interés, inicie el tratamiento el día de la inoculación celular de acuerdo con el protocolo experimental planificado y supervise el volumen del tumor primario dos veces por semana durante cuatro a seis semanas. Para el análisis dinámico PharmaCODE del tumor infiltrado células inmunitarias, picar los tejidos tumorales en trozos pequeños y digerir los fragmentos con colágeno tipo uno y DNase I y RPMI-1640 medio más 5%FBS durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Al final de la digestión, filtre el tejido digerido a través de un colador celular de 40 micrómetros para obtener una suspensión de una sola célula y recoger las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en un uno por 10 de las séptimas células por mililitro de concentración de búfer de fax frío helado y transferir un volumen igual de células al número adecuado de pozos en una placa inferior redonda de 96 pozos. Recoger las células por centrifugación y resuspend los pellets en 20 microgramos por mililitro de IGG humano durante 30 minutos para bloquear cualquier unión inespecífico. Luego manche las células con los anticuerpos primarios apropiados durante 30 minutos a cuatro grados Celsius antes de su análisis por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar.
Como se ha demostrado, 100 miligramos por kilogramo de ciclofosfamida y 125 miligramos por kilogramo de mieloablación disulfiram resulta en un agotamiento significativo de neutrófilos y monocitos cuatro días después del tratamiento. Después de la PBMC humana y el trasplante de tumores, la presencia de infiltrados de células inmunitarias humanas puede ser verificada dentro del microambiente tumoral por inmunohistoquímica. Se puede realizar un cribado in vivo de un panel de donantes de PBMC para confirmar la presencia de una infiltración relativamente alta de células inmunitarias en el microambiente tumoral en una tasa de crecimiento tumoral aceptable.
Las líneas celulares de cáncer humano en xenoinjertos derivados de pacientes de diferentes tipos de cáncer también se pueden evaluar para evaluar la tasa de crecimiento tumoral y la infiltración de células inmunitarias. En este experimento representativo, el tratamiento de la PBMC y los ratones humanizados injertados con anticuerpos anti-PD1 humanizados dieron lugar a actividades antitumorales significativas. Disulfiram disminuye la urotoxicidad de la ciclofosfamida, la combinación puede ejercer efectos de neutropenia más duraderos en ratones.
Es posible que sea necesario predeterminar el régimen de dosis exacto de ciclofosfamida y disulfiram. Se han establecido cepas más nuevas de ratones más inmunodeficientes para facilitar la reconstitución de la inmunidad humana y disminuir el efecto GvHD xenogénico y están pendientes de nuevas investigaciones con nuestro protocolo documentado. Nuestro modelo es útil para evaluar las terapias inmunitarias contra el cáncer que involucran a las células T, especialmente cuando se trabaja en plazos cortos o para seleccionar agentes antes de pasar a un modelo de inmunidad multilineal más complejo.
