Наш протокол может служить общим ориентиром для создания моделей мышей, воссозданных с помощью ПБМК человека и опухолей для иммуноонкологических исследований. Эти процедуры обеспечивают экономически эффективный и высоко воспроизводимый подход для частичного восстановления иммунитета человека у опухоленосных мышей человека через подкожное и смешивание ПБМК человека с раковыми ксенотрансплантами. Демонстрация процедур со мной будет Синьсин Цуй, Яньцзюань Чжан, Huichen Бай и Сяолун Ян, прислал нам из фармакологии департамента.
Для истощения миелоидных клеток внутри брюшной доставить 100 мг на килограмм циклофосфамида и устно доставить 125 мг на килограмм дисульфирама до шести-восьми недель NOD / SCID самок мышей один раз в день в течение двух дней. Через 24 часа после второй дозы циклофосфамида и дисульфирама, повторное использование пять раз 10 из шести недавно изолированных человека PBMC и 2,5 раза 10 из шести клеток опухолевой клетки человека и 200 микролитров PBS плюс 50%metrogel на животное и вводить весь объем подкожно в правый фланг каждого экспериментального животного. Измерьте и замитьте первичный объем опухоли два раза в неделю в течение четырех-шести недель.
Когда опухоли достигают среднего объема от 200 до 500 миллиметров куб, использовать оптомные ножницы для сбора всей опухоли от каждого животного. PBMC доноров опухолевых клеток линий и пациента, полученных ксенотрансплантатов, которые приводят к умеренному росту опухоли с относительно высоким PD-1, PD-L1 и CD8 выражение должно быть использовано для последующего анализа. Для иммуногистохимического анализа собранных опухолевых тканей, исправить образцы и формалин от 24 до 72 часов до обезвоживания и встраивания тканей в парафин.
Получить три микрометра разделов встроенных тканей на полилин покрытием слайдов и deparaffinize образцов с тремя семь минут погружения ксилена. После третьего лечения, гидрат секций с трехминутного градуированных погружений алкоголя. Затем трижды промойте горку в деионизированной воде и удалите излишки жидкости со горок.
Для выполнения поиска антигена поместите слайды в контейнер и накройте слайды 10-миллиметровым содиоцитратным буфером. Нагрейте горки, контейнер, в микроволновой печи в течение трех минут, прежде чем поместить горки в 95 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры, промыть слайды три раза в деионизированной воде и аспирировать любые излишки жидкости из слайдов.
Инкубировать с 0,3%перекиси водорода в течение 10 минут, чтобы блокировать эндогенной активности пероксидазы с последующим блокированием с 3%BSA и PBS в течение одного часа. В конце инкубации перекиси водорода, этикетки слайды с соответствующими первичными антителами при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро, лечить слайды с хреном peroxidase спряженных вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре перед применением субстрата dropwise на слайдах, пока соответствующий уровень коричневого окрашивания наблюдается световой микроскопии.
Далее, пятно образцов с гематоксилин. Через минуту прекратите реакцию с дистиллированной водой, а затем пять секунд погружения в 0,5%соляной кислоты алкоголя и пять секунд в 0,5%аммиака воды. Затем обезвоживают образцы с тремя восходящими три минуты этанола и три, пять минут погружения ксилена.
Для оценки противоопухоотной активности кандидата, представляющих интерес, инициируют лечение в день прививки клеток в соответствии с запланированным экспериментальным протоколом и два раза в неделю контролируют объем первичной опухоли в течение четырех-шести недель. Для PharmaCODE динамический анализ опухоли проникли иммунные клетки, фарш опухолевых тканей на мелкие кусочки и переварить фрагменты с коллагеназы типа 1 и DNase I и RPMI-1640 среднего плюс 5%FBS в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию. В конце пищеварения, фильтруемую ткань через 40 микрометровый клеточный ситечко, чтобы получить одноклеточную подвеску и собрать клетки путем центрифугации.
Переусердствуйте гранулы в один раз 10 седьмых клеток на миллилитр ледяной факс буферной концентрации и передачи равного объема клеток в соответствующее количество скважин в 96-хорошо круглой нижней пластины. Соберите клетки путем центрифугации и перерасход гранул в 20 микрограмм на миллилитр человека IGG в течение 30 минут, чтобы заблокировать любой неспецифический связывания. Затем окрашивают клетки соответствующими первичными антителами в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия до их анализа по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами.
Как было продемонстрировано, 100 миллиграммов на килограмм циклофосфамида и 125 миллиграммов на килограмм дисульфирама миелоаблирования приводит к значительному истощению нейтрофилов и моноцитов через четыре дня после лечения. После ПБМК человека и трансплантации опухоли, наличие иммунных клеток человека проникает может быть проверена в пределах микроокноронности опухоли иммуногистохимии. In vivo скрининг панели доноров PBMC может быть выполнена, чтобы подтвердить наличие относительно высокой инфильтрации иммунных клеток в микроокноронию опухоли в приемлемой скорости роста опухоли.
Линии раковых клеток человека у пациентов, полученных ксенотрансплантатов различных типов рака также могут быть оценены для оценки темпов роста опухоли и проникновения иммунных клеток. В этом репрезентативном эксперименте лечение ПБМК и привитых гуманизированных мышей с гуманизированными антителами против PD1 привело к значительной противоопухотьюлой деятельности. Дисульфирам снижает уротоксичность циклофосфамида, комбинация может оказывать более длительное действие нейтропении у мышей.
Точная доза режима циклофосфамид и дисульфирам, возможно, должны быть предопределены. Новые штаммы более иммунодефицитных мышей для облегчения восстановления иммунитета человека и снижение ксеногенного эффекта GvHD были созданы и ожидают дальнейших исследований с нашим документированным протоколом. Наша модель полезна для оценки Т-клеток привлечения рака иммунной терапии, особенно при работе на короткие сроки или для выбора агентов, прежде чем перейти к более сложной модели многолинейного иммунитета.
