Il nostro protocollo può servire come linea guida generale per stabilire modelli di topi ricostituiti con PBMC umano e tumori per la ricerca immuno-oncologica. Queste procedure forniscono un approccio economico e altamente riproducibile per ricostituire parzialmente l'immunità umana nei topi che portano tumori umani attraverso la sottocutanea e la miscelazione del PBMC umano con xenografti tumorali. A dimostrare le procedure con me saranno Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai e Xiaolong Yang, inviatici dal Dipartimento di Farmacologia.
Per l'esaurimento delle cellule mieloidi in modo intra peritoneale, consegnare 100 mg per chilogrammo di ciclofosfamide e consegnare oralmente 125 mg per chilogrammo di disolfiram a topi femmine NOD/SCID di sei-otto settimane una volta al giorno per due giorni. 24 ore dopo la seconda dose di ciclofosfamide e disulfiram, resospeso cinque volte 10 dei sei PBMC umani appena isolati e 2,5 volte 10 delle sei cellule della linea cellulare tumorale umana e 200 microlitri di PBS più il 50% di metrogel per animale e iniettare l'intero volume sottocutaneamente nel fianco destro di ogni animale sperimentale. Misurare e registrare il volume primario del tumore due volte a settimana per quattro o sei settimane.
Quando i tumori raggiungono un volume medio da 200 a 500 millimetri a cubetti, utilizzare forbici optomiche per raccogliere l'intero tumore da ogni animale. Pbmc donatori linee cellulari tumorali e xenoinnesti derivati dal paziente che si traducono in una moderata crescita tumorale con espressione relativamente alta PD-1, PD-L1 e CD8 devono essere utilizzati per analisi successive. Per l'analisi immunoistochimica dei tessuti tumorali raccolti, fissare i campioni e la formalina da 24 a 72 ore prima della disidratazione e dell'incorporamento dei tessuti in paraffina.
Ottenere tre sezioni di micrometro dei tessuti incorporati su vetrini rivestiti in polilisina e deparaffinizzare i campioni con tre immersioni in xilene di sette minuti. Dopo il terzo trattamento, idratare le sezioni con immersioni alcoliche classificate di tre minuti. Quindi sciacquare lo scivolo in acqua deionizzata tre volte e rimuovere il liquido in eccesso dagli scivoli.
Per eseguire il recupero dell'antigene, posizionare le diapositive in un contenitore e coprire le diapositive con tampone sodiocitrato da 10 millimolare. Riscaldare gli scivoli, il contenitore, in un forno a microonde per tre minuti prima di posizionare gli scivoli in un bagno d'acqua di 95 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, sciacquare gli scivoli tre volte in acqua deionizzata e aspirare qualsiasi liquido in eccesso dagli scivoli.
Incubare con lo 0,3% di perossido di idrogeno per 10 minuti per bloccare l'attività endogena della perossidasi seguita da blocco con 3%BSA e PBS per un'ora. Alla fine dell'incubazione di perossido di idrogeno, etichettare le diapositive con gli anticorpi primari appropriati a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, trattare le diapositive con anticorpo secondario coniugato di rafano perossidasi per un'ora a temperatura ambiente prima di applicare il substrato dropwise sulle diapositive fino a quando non si osserva un adeguato livello di colorazione marrone mediante microscopia leggera.
Quindi, macchiare i campioni con ematossilina. Dopo un minuto, interrompere la reazione con acqua distillata seguita da una immersione di cinque secondi nello 0,5% di alcol acido cloridrico e cinque secondi in acqua di ammoniaca allo 0,5%. Quindi disidratare i campioni con tre etanolo crescente di tre minuti e tre, cinque minuti di immersione in xilene.
Per valutare l'attività antitumore di un farmaco di interesse candidato, avviare il trattamento il giorno dell'inoculazione cellulare secondo il protocollo sperimentale pianificato e monitorare il volume primario del tumore due volte a settimana per quattro o sei settimane. Per l'analisi dinamica PharmaCODE delle cellule immunitarie infiltrate tumorali, tritare i tessuti tumorali in piccoli pezzi e digerire i frammenti con collagenasi di tipo uno e DNasi I e RPMI-1640 medium più 5%FBS per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, filtrare il tessuto digerito attraverso un colino cellulare di 40 micrometri per ottenere una sospensione a singola cellula e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
Resuspend il pellet ad una volta 10 delle settime celle per millilitro di concentrazione di tampone fax freddo ghiaccio e trasferire un volume uguale di cellule al numero appropriato di pozzi in una piastra inferiore rotonda di 96 pozzetti. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare i pellet in 20 microgrammi per millilitro di IGG umano per 30 minuti per bloccare qualsiasi legame non specifico. Quindi macchiare le cellule con gli anticorpi primari appropriati per 30 minuti a quattro gradi Celsius prima della loro analisi per citometria del flusso secondo protocolli standard.
Come dimostrato, 100 milligrammi per chilogrammo di ciclofosfamide e 125 milligrammi per chilogrammo di mieloablazione del disolfiram si traduce in un significativo impoverimento di neutrofili e monociti quattro giorni dopo il trattamento. Dopo il PBMC umano e il trapianto di tumore, la presenza di infiltrati delle cellule immunitarie umane può essere verificata all'interno del microambiente tumorale mediante immunoistochimica. Uno screening in vivo di un pannello di donatori pbmc può essere eseguito per confermare la presenza di un'infiltrazione di cellule immunitarie relativamente alta nel microambiente tumorale in un tasso di crescita tumorale accettabile.
Le linee cellulari tumorali umane negli xenoinnesti derivati dal paziente di diversi tipi di cancro possono anche essere valutate per valutare il tasso di crescita del tumore e l'infiltrazione delle cellule immunitarie. In questo esperimento rappresentativo, il trattamento del PBMC e dei topi umanizzati innestati con anticorpi anti-PD1 umanizzati ha portato a significative attività antitumorali. Disulfiram diminuisce l'urotossicità della ciclofosfamide, la combinazione può esercitare effetti neutropenia più duraturi nei topi.
Il regime di dose esatto di ciclofosfamide e disulfiram potrebbe dover essere predeterminato. Sono stati stabiliti ceppi più nuovi di topi più immunodifesi per una più facile ricostituzione dell'immunità umana e una diminuzione dell'effetto GvHD xenogenico e sono in attesa di ulteriori indagini con il nostro protocollo documentato. Il nostro modello è utile per valutare le terapie immunitarie tumorali coinvolgenti delle cellule T, in particolare quando si lavora su tempi brevi o per selezionare agenti prima di passare a un modello di immunità multilinea più complesso.
