يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث أثناء التمايز النخاعي العادي للخلايا الجذعية والنسلية الإيجابية لدمية CD34 البشرية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يسمح للتمايز من الخلايا الإيجابية CD34 على طول جميع الأراضي النخاعية الأربعة بما في ذلك megakaryocytes, كريات الدم الحمراء, الحبيبات, ومونودات. إثبات الإجراء سيكون (أديتي بابات) ، طبيبة ما بعد الدكتوراه من مختبري
لعزل الخلية أحادية النواة من عينة دم الحبل السري البشري، تعقيم السطح الخارجي لحقيبة من دم الحبل السري مع 70٪ الإيثانول قبل نقل محتويات الحقيبة إلى زجاجة بلاستيكية معقمة 250 ملليلتر داخل خزانة السلامة البيولوجية. تخفيف الدم مع حجم متساو من درجة حرارة الغرفة هانك محلول ملحي المخزنة، وإضافة 15 ملليلتر من تجزئة خلية أحادية النواة المتوسطة إلى كل من خمسة أنابيب مخروطية معقم 50 ملليلتر. بعد خلط لطيف، صب بعناية 30 ملليلتر من دم الحبل السري المخفف على المتوسطة تجزئة أحادية النوى في كل أنبوب، وعقد أنابيب 50 ملليلتر في زاوية للمساعدة في تجنب خلط الطبقات.
فصل الخلايا بواسطة الطاردة المركزية للتدرج الكثافة، وإزالة أعلى 15 إلى 20 ملليلتر من البلازما فوق طبقة الخلية أحادية النوى. استخدم ماصة لنقل طبقة الخلية أحادية النوى المكشوفة بعناية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر، وتجميع الخلايا أحادية النوى من أنبوبين إلى ثلاثة أنابيب معًا، وجلب الحجم النهائي في كل أنبوب يصل إلى 50 ملليلترًا مع عازل PBE البارد. بيليه عينات الخلية أحادية النوى عن طريق الطرد المركزي، وpirate المناذرات.
اضغط على كل أنبوب بلطف لتخفيف الكريات الخلية، وتمييع الكريات في خمسة ملليلتر من الجليد الباردة PBE العازلة. الجمع بين الخلايا من ثلاثة إلى أربعة أنابيب في أنبوب واحد مخروطي 50 ملليلتر، وغسل جميع الأنابيب مع خمسة ملليلتر من عازلة PBE جديدة لجمع أي الخلايا المتبقية. بعد العد، وجلب حجم النهائي في أنبوب تصل إلى 50 ملليلتر مع الجليد الطازج الباردة PBE العازلة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
لعزل الخلايا أحادية النوى الإيجابية CD34، إعادة تعليق بيليه في 50 ملليلتر من العازلة PBE جديدة قبل جمع الخلايا مع طرد مركز آخر. بعد التخلص من الفائق، انقر بلطف لتخفيف بيليه، وإعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا أحادية النوى ثمانية لكل 300 ميكرولترات من الجليد الباردة PBE تركيز العازلة. كتلة أي ربط غير محدد مع 100 ميكرولتررس من مستقبلات Fc عرقلة الكاشف، مزيج بلطف، ومن ثم إضافة 100 ميكرولترات من الميكروبات CD34 من الخلايا تنشيط مغناطيسية الخلايا تنشيط CD34 مجموعة الميكروبات في واحد مرات 10 إلى الخلايا الثماني مع خلط لطيف، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.
أثناء احتضان الخلايا، ضع عمود LS وتصفية ما قبل الفصل في مجال مغناطيسي فاصل MACS. اكويبير العمود مع ميليلترين من الجليد الباردة PBE العازلة ومرشح ما قبل الفصل مع ملليلتر واحد من العازلة. السماح للعمود لإفراغ في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وتجاهل تدفق من خلال.
في نهاية الحضانة، وجلب الحجم النهائي لعينة الخلية أحادية النواة تصل إلى 15 ملليلتر مع الجليد الطازج الباردة PBE العازلة ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الجليد الباردة PBE العازلة وتحميل الخلايا على مرشح ما قبل الفصل على العمود. شطف الأنبوب مع ثلاثة ملليلتر من الجليد الطازج الباردة PBE العازلة وإضافة العازلة إلى مرشح ما قبل الانفصال.
اغسل العمود أربع مرات مع ثلاثة ملليلترات إضافية من الجليد البارد PBE العازلة لكل غسل دون مرشح، مما يسمح للعمود استنزاف كامل بين كل غسل. بعد الغسيل النهائي، قم بتحريك العمود إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر، واغرق خمسة ملليلترات من الجليد الطازج البارد PBE من خلال العمود إلى الأنبوب. لتحديد كسور من الجذعية والنسل في مجموعات معزولة حديثا CD34 الجذعية الإيجابية والخلايا السلف، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل 50 ميكرولترات من تركيز تدفق الخلايا العازلة.
بعد ذلك، نقل الخلايا في 50 ميكرولتر aliquots لكل خمسة ملليلتر فلورية تنشيط أنبوب فرز الخلايا وفقا لبروتوكول التلطخ الخلوي تدفق التجريبية. إضافة كوكتيل الأجسام المضادة المناسبة وتلطيخ حية / ميتة إلى الخلايا، وضبط حجم إلى 100 ميكرولترات الكلي. بعد 20 دقيقة في الظلام المحمية من الضوء، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من تدفق جديد العازلة قياس الخلايا في الأنبوب الواحد، وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من تدفق جديد عازلة قياس الخلايا في الأنبوب الواحد.
ثم تحليل الخلايا على تدفق مقياس الخلايا وفقا للبروتوكولات السيتوميترية تدفق القياسية. للتمييز الميكروبية المعزولة CD34 الجذعية الإيجابية والخلايا السلف في خلايا النسب النخاعي، معطف أولا آبار لوحة عقيمة، غير المصقول 48 جيدا مع 200 ميكرولتر في بئر من محلول الليفية الإنسان المؤتلف في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، والتخلص من محلول فيبرومينكتين من كل بئر ومنع الآبار مع 200 ميكرولترات من 2٪ من الألبومين المصل البقري.
بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الآبار مرتين مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقمة في غسل. إعادة تعليق الخلايا الإيجابية CD34 المعزولة حديثا في خمس مرات 10 الخلايا الخمس لكل ملليلتر من التركيز المتوسط التحفيز الدافئ. بعد ذلك ، بذور 200 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من لوحة مغلفة جزء من الليفية ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.
في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا مع الأنابيب لطيف، وغسل الآبار مع 500 ميكرولترات من مدفئ Dulbecco معدلة النسر المتوسطة، تجمع يغسل مع تعليق الخلية. بعد العد، وإعادة تعليق الخلايا في 2.5 مرات 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر واحد من تركيز التمايز النخاعي المتوسطة. طبقة 200 ميكرولتررس من الخلايا الإيجابية CD34 في بئر في خلية سترومال MS-5 بذر 48 جيدا لوحة الأنسجة ثقافة.
ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية ، واستبدال 100 ميكرولترات من المابير في كل بئر مع 100 ميكرولترات من 2X تمايز 2X جديد المتوسطة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. في اليوم 21، حصاد الخلايا لتحليل التعبير علامة النسب النخاعي عن طريق تدفق cytometry كما أظهرت للتو. النسبة المئوية النموذجية من مجموع الخلايا الإيجابية CD34 معزولة عن دم الحبل السري عن طريق فصل الميكروبات كما يدل على أن يتراوح بين 80 إلى 90٪ تحليل المناعة المناعة يكشف أن هذه الخلايا الإيجابية CD34 تتكون عادة من ما يقرب من 20٪ نسب سالب CD34 إيجابية CD38 إيجابية CD38 السليفة السلبية السكان الخلايا الجذعية و72٪ نسب السلبية CD34 إيجابية CD38 إيجابية متعددة قوية الخلية السلف.
داخل السكان الخلية السلف متعددة قوية, حوالي 25٪ من الخلايا التعبير عن علامات سلف النخاعية المشتركة, حوالي 15٪ أعرب عن المحببة monocyte علامات السلف, وحوالي 56٪ أعرب megakaryocyte علامات سلف رليرويد. يوضح النادونينفينيبلينغ المناعي أيضًا أن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية CD34 تقلل من حوالي 90٪ في العزلة إلى أقل من 25٪ في اليوم 21. تحليل السكان السلبي CD34 يدل على ارتفاع يصاحب ذلك في النسبة المئوية للخلايا التعبير عن علامات النسب النخاعي ناضجة.
علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا الملطخة رايت غيمسا خصائص مورفولوجية متميزة في الأيام الأولى و 21 مع الثقافات غير المتمايزة التي تعرض نواة كبيرة ومستديرة والقليل جدًا من السيتوبلازم والثقافات المتمايزة التي تعرض خصائص المورفولوجية لخلايا النسب بما في ذلك التي هي أحادية اللون ، والمجلدات الحبيبية ، والريثروبلاستس. تذكر أن تصب دم الحبل السري المخفف على وسط تجزئة الخلية أحادية النوى دون خلط الطبقات، ولا تزعج الخلايا الإيجابية MS-5 و CD34 عند تغيير الوسط. بعد هذا البروتوكول التمايز، يمكن تحليل الخلايا الإيجابية CD34 الثقافات للتغيرات المورفولوجية، والآثار المبرمج، والتغيرات في أنماط دورة الخلية، ودرجة التمايز.
