该协议可用于研究人类CD34阳性造血干细胞和祖细胞的正常骨髓分化过程中发生的分子和细胞变化。该协议的主要优点是，它允许CD34正细胞沿着所有四个骨髓血统，包括巨核细胞，红细胞，粒细胞和单核细胞分化。演示程序将是阿迪提巴帕特，一个后医生从我的实验室。
要从人体脐带血样本中分离出单核细胞，在将袋内脂肪转移到生物安全柜内的无菌 250 毫升塑料瓶中之前，用 70% 乙醇对一袋脐带血的外表面进行消毒。用同等体积的室温稀释血液汉克缓冲盐水溶液，并在五个无菌的50毫升锥形管中加入15毫升的单核细胞分馏介质。轻轻混合后，小心地将30毫升稀释的脐带血倒入每个管的单核分馏介质上，以一定角度握住50毫升管，以避免混合层。
通过密度梯度离心分离细胞，并去除单核细胞层上方的15至20毫升等离子体。使用移液器小心地将暴露的单核细胞层转移到新的50毫升管中，将单核细胞从两个管汇集到三个管，并将每个管中的最终体积与冷PBE缓冲液一起带到50毫升。通过离心对单核细胞样品进行浸渍，并吸进超盐。
轻轻敲击每个管以松开细胞颗粒，并在五毫升冰冷的PBE缓冲液中稀释颗粒。将三到四管的细胞组合成一个50毫升的圆锥管，用五毫升的新鲜PBE缓冲液清洗所有管，收集任何剩余的细胞。数数后，用新鲜的冰冷PBE缓冲液将管子中的最终体积调至50毫升，通过离心收集细胞。
要分离CD34正单核细胞，在收集细胞进行另一离心之前，将颗粒重新悬浮在50毫升新鲜PBE缓冲液中。丢弃上清液后，轻轻敲击以松开颗粒，并在每300微升冰冷PBE缓冲液浓度的1倍10至8个单核细胞下重新悬浮。用100微升Fc受体阻断试剂进行阻断，轻轻混合，然后从磁性活性细胞分拣人类CD34微珠试剂盒中加入100微升CD34微珠，每10次加入8个细胞，轻轻混合，在4摄氏度下孵育细胞30分钟。
当细胞孵育时，将LS柱和预分离滤波器放在MACS分离器磁场中。用两毫升的冰冷 PBE 缓冲液和一毫升缓冲液平衡柱和预分离过滤器。让柱空入 15 毫升锥形管中，然后丢弃流经。
在孵育结束时，将单核细胞样本的最终体积与新鲜冰冷PBE缓冲液一起带到15毫升，通过离心沉淀细胞。将颗粒重新悬浮在一毫升冰冷的 PBE 缓冲液中，将电池加载到柱上的预分离过滤器上。用三毫升新鲜冰冷 PBE 缓冲液冲洗管子，并将缓冲液添加到预分离过滤器中。
每次洗涤时，无需过滤器，则使用额外的三毫升冰冷 PBE 缓冲液清洗柱四次，使柱在每次洗涤之间完全排空。最后洗涤后，将柱移入新的 15 毫升管中，将 5 毫升新鲜冰冷 PBE 通过柱插入管中。要确定新鲜分离的CD34阳性造血干细胞和祖细胞中干细胞和祖细胞群的分数，通过离心收集细胞，并在每50微升流动细胞体缓冲液浓度的10至6个细胞下重新悬浮细胞。
接下来，根据实验流细胞仪染色方案，每5毫升荧光激活细胞分拣管中转移50微升等分的细胞。向细胞中加入适当的抗体鸡尾酒和活/死染色，将体积调整为100微升。在黑暗中20分钟后，每管用一毫升新鲜流动细胞学缓冲液清洗细胞，每管用500微升新鲜流动细胞测量缓冲液重新悬浮细胞。
然后根据标准流量细胞测量方案分析流细胞仪上的细胞。为了将微珠分离的CD34正茎和祖细胞分化成骨髓血统细胞，首先在PBS中每孔重组人类纤维素素溶液中，用200微升覆盖无菌、未涂覆的48孔板的孔，在室温下两小时。在孵化结束时，丢弃每口井中的纤维素溶液，用200微升2%牛血清白蛋白阻断油井。
在室温下30分钟后，每次洗涤用500微升无菌PBS洗两次。重新悬浮新鲜分离的CD34阳性细胞，每毫升温暖刺激中等浓度的5倍10。接下来，将200微升细胞种子放入纤维素片段涂层板的每个井中，将该细胞放在细胞培养培养箱中48小时。
在孵化结束时，用温和的移液收集细胞，用500微升加热Dulbecco的改良鹰介质清洗孔，用细胞悬浮液将洗涤液集中起来。计数后，将细胞以每毫升骨髓分化介质浓度的2.5倍10重新悬浮到4个细胞。每井CD34阳性细胞层200微升，MS-5频闪细胞种子48井组织培养板。
然后将盘子放在细胞培养培养箱中，每井用100微升新鲜2X骨髓分化介质轻轻更换100微升。第21天，通过流式细胞学收集细胞，用于分析骨髓谱谱标记表达，正如刚刚证明的。通过微珠分离从脐带血分离出的CD34阳性细胞的典型百分比，如80至90%的免疫细胞分析显示，这些CD34阳性细胞通常由大约20%的血统阴性CD34阳性CD38阴性造血干细胞组和72%的血统阴性CD34阳性的多能祖细胞群体组成。
在多能祖细胞群体中，约25%的细胞表达常见的骨髓祖细胞标记，约15%表达粒细胞单细胞祖细胞祖先标记，约56%表达巨核细胞红细胞祖细胞祖细胞标记。免疫细胞分位还表明，CD34阳性细胞的百分比从隔离时约90%降低到第21天的25%以下。对CD34负种群的分析表明，表达成熟骨髓血统标记的细胞的百分比也同时上升。
此外，Wright-Giemsa染色细胞在第1天和21天表现出明显的形态特征，未分化的培养物表现出大、圆核和极小的细胞质，分化培养物表现出血统细胞的形态特征，包括单细胞、粒细胞和红细胞。请记住，在不混合层的情况下将稀释的脐带血倒入单核细胞分馏介质上，在改变介质时不要干扰MS-5和CD34阳性细胞。按照此分化协议，CD34正细胞培养物可以分析形态变化、凋亡效应、细胞周期模式变化和分化程度。
