Este protocolo pode ser usado para estudar as alterações moleculares e celulares que ocorrem durante a diferenciação mielóide normal das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras humanas. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite a diferenciação de células positivas CD34 ao longo de todas as quatro linhagens mieloides, incluindo megacaiócitos, eritrócitos, granuócitos e monócitos. Demonstrando o procedimento será Aditi Bapat, uma pós-doutora do meu laboratório.
Para o isolamento celular mononuclear de uma amostra de sangue do cordão umbilical humano, esterilize a superfície externa de um saco de sangue do cordão umbilical com 70% de etanol antes de transferir o conteúdo do saco para uma garrafa plástica estéril de 250 mililitros dentro de um armário de segurança biológica. Diluir o sangue com um volume igual de temperatura ambiente A solução salina tamponada de Hank, e adicionar 15 mililitros de fracionamento de células mononucleares médio para cada um dos cinco tubos cônicos estéreis de 50 mililitros. Após uma mistura suave, despeje cuidadosamente 30 mililitros do sangue diluído do cordão umbilical no meio de fracionamento mononuclear em cada tubo, segurando os tubos de 50 mililitros em um ângulo para ajudar a evitar a mistura das camadas.
Separe as células por centrifugação gradiente de densidade, e remova os 15 a 20 mililitros superiores à camada de célula mononuclear. Use uma pipeta para transferir cuidadosamente a camada de célula mononuclear exposta em um novo tubo de 50 mililitros, unindo as células mononucleares de dois a três tubos juntos, e traga o volume final em cada tubo até 50 mililitros com tampão PBE frio. Pellte as amostras de células mononucleares por centrifugação, e aspire os supernantes.
Bata em cada tubo suavemente para soltar as pelotas celulares e dilua as pelotas em cinco mililitros de tampão PBE gelado. Combine as células de três a quatro tubos em um tubo cônico de 50 mililitros, e lave todos os tubos com cinco mililitros de tampão PBE fresco para coletar quaisquer células restantes. Após a contagem, leve o volume final no tubo até 50 mililitros com tampão PBE frio fresco e colete as células por centrifugação.
Para isolar as células mononucleares positivas CD34, suspenda a pelota em 50 mililitros de tampão PBE fresco antes de coletar as células com outra centrifugação. Depois de descartar o supernascer, bata suavemente para soltar a pelota, e suspenda as células em uma única vez 10 para as oito células mononucleares por 300 microliters de concentração de tampão PBE gelada. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microlitres de reagente de bloqueio do receptor Fc, misture suavemente e, em seguida, adicione 100 micro-ebuligem de microesferas CD34 de um kit de microesferas humanos ativados magnéticos por uma vez 10 às oito células com mistura suave, e incubar as células por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS e filtro de pré-separação em um campo magnético separador MACS. Equilibre a coluna com dois mililitros de tampão PBE gelado e o filtro de pré-separação com um mililitro de buffer. Deixe a coluna esvaziar em um tubo cônico de 15 mililitros e descarte o fluxo através.
Ao final da incubação, traga o volume final da amostra de célula mononuclear até 15 mililitros com tampão PBE frio fresco e sedimentar as células por centrifugação. Suspenda a pelota em um mililitro de tampão PBE frio e carregue as células no filtro de pré-separação na coluna. Enxágüe o tubo com três mililitros de tampão PBE frio fresco e adicione o tampão ao filtro de pré-separação.
Lave a coluna quatro vezes com mais três mililitros de tampão PBE gelado por lavagem sem o filtro, permitindo que a coluna escorra completamente entre cada lavagem. Após a lavagem final, mova a coluna para um novo tubo de 15 mililitros, e mergulhe cinco mililitros de PBE frio fresco através da coluna para o tubo. Para determinar as frações de populações de caules e progenitores nas células hematopoiéticas e progenitoras recém-isoladas cd34, coletar as células por centrifugação e suspender a pelota em uma única vez 10 para as seis células por 50 microliters de concentração de tampão de citometria de fluxo.
Em seguida, transfira as células em 50 alíquotas de microliter por cinco mililitros fluorescência ativada tubo de triagem celular de acordo com o protocolo experimental de coloração de citometria de fluxo. Adicione o coquetel de anticorpos apropriado e coloração viva/morta às células, ajustando o volume para 100 microliters totais. Após 20 minutos no escuro protegido da luz, lave as células com um mililitro de tampão de citometria de fluxo fresco por tubo, e suspenda as células em 500 microliters de tampão de citometria de fluxo fresco por tubo.
Em seguida, analise as células em um citômetro de fluxo de acordo com protocolos citométricos de fluxo padrão. Para diferenciar as células de tronco e progenitoras cd34 positivas em células de linhagem mieloide, primeiro cubra os poços de uma placa estéril e sem revestimento de 48 poços com 200 microlitadores por poço de solução de fibronectina humana recombinante em PBS por duas horas à temperatura ambiente. Ao final da incubação, descarte a solução de fibronectina de cada poço e bloqueie os poços com 200 microliters de 2% de albumina de soro bovino.
Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave os poços duas vezes com 500 microliters de PBS estéril por lavagem. Suspenda as células positivas CD34 recém-isoladas a cinco vezes 10 as cinco células por mililitro de concentração média de estimulação quente. Em seguida, semente 200 microliters de células em cada poço da placa revestida de fragmento de fibronectina e coloque a placa na incubadora de cultura celular por 48 horas.
No final da incubação, colete as células com tubulação suave, e lave os poços com 500 microliters do meio águia modificado de Dulbecco aquecido, unindo as lavagens com a suspensão da célula. Após a contagem, suspenda as células em 2,5 vezes 10 para as quatro células por um mililitro de concentração média de diferenciação mielóide. Camada 200 microliters de células positivas CD34 por poço em uma célula estromal MS-5 semeada 48 placa de cultura tecidual bem.
Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular, substituindo suavemente 100 microliters do supernante em cada poço com 100 microliters de meio de diferenciação mielóide 2X fresco a cada três ou quatro dias. No dia 21, colhe as células para análise da expressão do marcador de linhagem mieloide por citometria de fluxo como apenas demonstrado. A porcentagem típica de células positivas cd34 isoladas do sangue do cordão umbilical por separação de microesferas como demonstrado varia entre 80 a 90% A análise imunofenofípica revela que essas células positivas CD34 geralmente consistem em uma linhagem negativa de aproximadamente 20% cd34 positiva cd38 população de células-tronco hematopoiéticas negativas e uma linhagem negativa CD34 positivo CD38 população de células progenitoras positivas.
Dentro da população multipotente de células progenitoras, cerca de 25% das células expressam marcadores progenitores mieloides comuns, cerca de 15% expressam marcadores progenitores de monogenitor de granlócitos expressos, e cerca de 56% expressam marcadores progenitores de megacariódias. A imunofenofoteping também demonstra que o percentual de células positivas de CD34 reduz de cerca de 90% de isolamento para menos de 25% no dia 21. A análise da população negativa do CD34 demonstra um aumento concomitante no percentual de células expressando marcadores de linhagem mieloide madura.
Além disso, as células manchadas de Wright-Giemsa demonstram características morfológicas distintas nos dias um e 21 com as culturas indiferenciadas exibindo grandes núcleos redondos e muito pouco citoplasma e as culturas diferenciadas que exibem características morfológicas de células de linhagem, incluindo monócitos, granulócitos e eritrobistas. Lembre-se de despejar o sangue diluído do cordão umbilical no meio de fracionamento da célula mononuclear sem misturar as camadas, e não perturbe as células positivas MS-5 e CD34 ao alterar o meio. Seguindo esse protocolo de diferenciação, as culturas celulares positivas cd34 podem ser analisadas para alterações morfológicas, efeitos apoptóticos, mudanças nos padrões de ciclo celular e o grau de diferenciação.
