Ce protocole peut être utilisé pour étudier les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au cours de la différenciation myéloïde normale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices positives cd34 humaines. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet la différenciation des cellules cd34 positives le long des quatre lignées myéloïdes, y compris les mégacaryocytes, érythrocytes, granulocytes et monocytes. Aditi Bapat, post-doc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour l’isolement cellulaire mononucléaire d’un échantillon de sang de cordon ombilical humain, stérilisez la surface externe d’un sac de sang de cordon ombilical avec 70% d’éthanol avant de transférer le contenu du sac dans une bouteille en plastique stérile de 250 millilitres dans une armoire de sécurité biologique. Diluer le sang avec un volume égal de la solution saline tamponnée de Hank à température ambiante, et ajouter 15 millilitres de milieu de fractionnement cellulaire mononucléaire à chacun des cinq tubes coniques stériles de 50 millilitres. Après un mélange doux, versez soigneusement 30 millilitres de sang de cordon ombilical dilué sur le milieu de fractionnement mononucléaire dans chaque tube, en tenant les tubes de 50 millilitres à un angle pour éviter de mélanger les couches.
Séparez les cellules par centrifugation de gradient de densité, et retirez les 15 à 20 millilitres supérieurs de plasma au-dessus de la couche mononucléaire de cellules. Utilisez une pipette pour transférer soigneusement la couche cellulaire mononucléaire exposée dans un nouveau tube de 50 millilitres, en mettant en commun les cellules mononucléaires de deux à trois tubes ensemble, et amener le volume final dans chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon PBE froid. Pelleter les échantillons de cellules mononucléaires par centrifugation, et aspirer les supernatants.
Appuyez doucement sur chaque tube pour desserrer les granulés cellulaires et diluer les granulés en cinq millilitres de tampon PBE glacé. Combinez les cellules de trois à quatre tubes dans un tube conique de 50 millilitres, et lavez tous les tubes avec cinq millilitres de tampon PBE frais pour recueillir les cellules restantes. Après compter, porter le volume final dans le tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon PBE froid de glace fraîche, et recueillir les cellules par centrifugation.
Pour isoler les cellules mononucléaires positives CD34, suspendez la pastille en 50 millilitres de tampon PBE frais avant de recueillir les cellules avec une autre centrifugation. Après avoir jeté le surnatant, appuyez doucement pour desserrer la pastille, et re-suspendre les cellules à une fois 10 aux huit cellules mononucléaires par 300 microlitres de concentration tampon de PBE froid. Bloquez toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de récepteur Fc bloquant le réaccente, mélangez doucement, puis ajoutez 100 microlitres de microlitres de microbilles CD34 à partir d’un kit de microbille de CD34 humain activé magnétique par une fois 10 aux huit cellules avec mélange doux, et incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Pendant que les cellules couvent, placez une colonne LS et un filtre de pré-séparation dans un champ magnétique de séparateur MACS. Equilibrer la colonne avec deux millilitres de tampon PBE glacé et le filtre de pré-séparation avec un millilitre de tampon. Laissez la colonne se vider dans un tube conique de 15 millilitres et jetez l’écoulement.
À la fin de l’incubation, amener le volume final de l’échantillon de cellules mononucléaires jusqu’à 15 millilitres avec tampon PBE froid de glace fraîche et sédimenter les cellules par centrifugation. Suspendez à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon PBE glacé et chargez les cellules sur le filtre de pré-séparation sur la colonne. Rincez le tube avec trois millilitres de tampon PBE froid de glace fraîche et ajoutez le tampon au filtre de pré-séparation.
Lavez la colonne quatre fois avec trois millilitres supplémentaires de tampon PBE glacé par lavage sans filtre, ce qui permet à la colonne de s’écouler complètement entre chaque lavage. Après le lavage final, déplacez la colonne dans un nouveau tube de 15 millilitres, et plongez cinq millilitres de PBE froid de glace fraîche à travers la colonne dans le tube. Pour déterminer les fractions des populations de tiges et de progéniteurs dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques positives fraîchement isolées, recueillez les cellules par centrifugation et suspendez la pastille à une fois 10 à six cellules pour 50 microlitres de concentration tampon de cytométrie d’écoulement.
Ensuite, transférez les cellules en aliquots de 50 microlitres par tube de tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres selon le protocole expérimental de coloration de cytométrie du flux. Ajoutez le cocktail d’anticorps approprié et la coloration vivante/morte aux cellules, en ajustant le volume à 100 microlitres totaux. Après 20 minutes dans l’obscurité à l’abri de la lumière, laver les cellules avec un millilitre de tampon de cytométrie d’écoulement frais par tube, et de suspendre à nouveau les cellules dans 500 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement frais par tube.
Ensuite, analyser les cellules sur un cytomètre d’écoulement selon les protocoles cytométriques d’écoulement standard. Pour différencier la microbille isolée de cellules souches et progénitrices cd34 positives en cellules de lignée myéloïde, enduire d’abord les puits d’une plaque stérile et non encolée de 48 puits avec 200 microlitres par puits de solution de fibronectine humaine recombinante en PBS pendant deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, jeter la solution de fibronectine de chaque puits et bloquer les puits avec 200 microlitres d’albumine sérique bovine à 2 %.
Après 30 minutes à température ambiante, laver les puits deux fois avec 500 microlitres de PBS stérile par lavage. Suspendre à nouveau les cellules positives CD34 fraîchement isolées à cinq fois 10 les cinq cellules par millilitre de concentration moyenne de stimulation chaude. Ensuite, les graines 200 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque enduite de fragment de fibronectine et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures.
À la fin de l’incubation, recueillir les cellules avec pipetting doux, et laver les puits avec 500 microlitres de chaud Dulbecco modifié Eagle moyen, la mise en commun des lavages avec la suspension cellulaire. Après comptage, re-suspendre les cellules à un 2,5 fois 10 aux quatre cellules par millilitre de différenciation myéloïde concentration moyenne. Couche 200 microlitres de cellules cd34 positives par puits dans une cellule stromal MS-5 ensemencée 48 plaque de culture de tissu de puits.
Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, remplaçant doucement 100 microlitres du supernatant dans chaque puits avec 100 microlitres de milieu de différenciation myéloïde 2X frais tous les trois à quatre jours. Le jour 21, récoltez les cellules pour l’analyse de l’expression de marqueur de lignée myéloïde par cytométrie d’écoulement comme juste démontré. Le pourcentage typique de cellules positives CD34 totales isolées du sang de cordon ombilical par séparation des microbilles selon les fourchettes démontrées entre 80 et 90%Analyse immunophénotopypique révèle que ces cellules positives CD34 se composent généralement d’une lignée négative CD34 positive CD34 positive CD38 population négative de cellules souches hématopoïétiques et d’une lignée négative cd34 positive CD38 positive population de cellules progénitrices multi-puissantes.
Dans la population multi-puissante de cellules progénitrices, environ 25% des cellules expriment des marqueurs progéniteurs myéloïdes communs, environ 15% expriment des marqueurs progéniteurs de monocyte de granulocyte, et environ 56% expriment des marqueurs d’ancêtre érythroïde de mégakaryocyte. L’immunophéotypage démontre également que le pourcentage de cellules cd34 positives passe d’environ 90 % à l’isolement à moins de 25 % le jour 21. L’analyse de la population négative de CD34 démontre une augmentation concomitante du pourcentage de cellules exprimant des marqueurs myéloïdes matures de lignée.
En outre, les cellules tachées wright-giemsa démontrent des caractéristiques morphologiques distinctes les jours un et 21 avec les cultures indifférenciées présentant de grands noyaux ronds et très peu de cytoplasme et les cultures différenciées affichant des caractéristiques morphologiques des cellules de lignée comprenant qui sont des monocytes, des granulocytes, et des érythroblastes. N’oubliez pas de verser le sang de cordon dilué sur le milieu de fractionnement cellulaire mononucléaire sans mélanger les couches, et ne pas déranger les cellules sM-5 et CD34 positives lors du changement du milieu. Suivant ce protocole de différenciation, les cultures cellulaires positives CD34 peuvent être analysées pour les changements morphologiques, les effets apoptotiques, les changements dans les modèles de cycle cellulaire, et le degré de différenciation.
