Bu protokol, insan CD34 pozitif hematopoetik kök ve atajen hücrelerinin normal miyeloid farklılaşması sırasında meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün en büyük avantajı megakaryositler, eritrositler, granülositler ve monositler de dahil olmak üzere dört miyeloid soy boyunca CD34 pozitif hücrelerin farklılaşmasını sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Aditi Bapat, benim laboratuvar bir post-doc olacaktır.
Bir insan göbek kordonkan kan örneğinden mononükleer hücre izolasyonu için, biyolojik bir güvenlik kabini içinde steril bir 250 mililitre plastik şişe içine çanta içeriğini aktarmadan önce% 70 etanol ile göbek kordon kanı bir çanta dış yüzeyi sterilize. Oda sıcaklığında Hank'in tamponlu tuzlu çözeltieşit hacimli kan seyreltmek ve beş steril 50 mililitre konik tüpler her biri için mononükleer hücre fraksiyonu orta 15 mililitre ekleyin. Nazik karıştırma sonra, dikkatle her tüp mononükleer fraksiyonlama orta üzerine seyreltilmiş göbek kordon kanı 30 mililitre dökün, katmanları karıştırma önlemek için bir açıda 50 mililitre tüpler tutarak.
Yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın ve mononükleer hücre tabakasıüzerinde plazma üst 15 ila 20 mililitre kaldırın. Maruz kalan mononükleer hücre tabakasını yeni bir 50 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarmak, mononükleer hücreleri iki ila üç tüpten bir araya getirmek ve her tüpteki son hacmi soğuk PBE tamponuyla 50 mililitreye kadar getirmek için bir pipet kullanın. Mononükleer hücre örneklerini santrifüj ile peletleyin ve süpernatantları aspire edin.
Hücre peletlerini gevşetmek için her tüpe hafifçe dokunun ve peletleri beş mililitre lik buz gibi PBE tamponu yla seyreltin. Bir 50 mililitrekonik tüp içine üç ila dört tüpler hücreleri birleştirin ve kalan hücreleri toplamak için taze PBE tampon beş mililitre ile tüm tüpleri yıkayın. Sayma sonra, taze buz soğuk PBE tampon ile 50 mililitreye kadar tüp son hacmi getirmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
CD34 pozitif mononükleer hücreleri izole etmek için, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamadan önce taze PBE tampon 50 mililitre pelet yeniden askıya. Supernatant attıktan sonra, pelet gevşetmek için yavaşça dokunun ve buz soğuk PBE tampon konsantrasyonu 300 mikrolitre başına sekiz mononükleer hücrelere bir kez 10 hücreleri yeniden askıya. Fc reseptör bloke reaktif 100 mikrolitre ile herhangi bir nonspesifik bağlama blok, yavaşça karıştırın, ve sonra bir manyetik aktif hücre sıralama insan CD34 mikroboncuk kiti 100 mikrolitre ekleyin 10 nazik karıştırma ile sekiz hücreye 10, ve dört derece santigrat hücreleri kuluçka.
Hücreler kuluçkaya yatarken, BIR MACS ayırıcı manyetik alana bir LS sütunu ve ön ayırma filtresi yerleştirin. Kolonu iki mililitre buz gibi PBE tamponu ve bir mililitre arabellek ile ön ayırma filtresi ile dengeleyin. Sütunun 15 mililitrelik konik bir tüpe boşalmasına izin verin ve akışı atın.
Kuluçka sonunda, taze buz soğuk PBE tampon ve santrifüj ile hücreleri tortu ile 15 mililitreye kadar mononükleer hücre örneğinin son hacmini getirmek. Bir mililitrelik buz gibi PBE tamponunda peleti yeniden askıya alın ve hücreleri sütundaki ön ayırma filtresine yükleyin. Tüpü üç mililitre taze buz gibi pbe tamponuyla durulayın ve arabelleği ön ayırma filtresine ekleyin.
Kolon, filtre olmadan yıkama başına üç mililitre daha buz gibi PBE tamponuyla dört kez yıkayın ve kolon her yıkama arasında tamamen boşalmasını sağlar. Son yıkamadan sonra, sütunu 15 mililitrelik yeni bir tüpe taşıyın ve beş mililitre taze buz gibi pBE'yi kolondan tüpe daldırın. Taze izole CD34 pozitif hematopoetik kök ve progenitor hücrelerinde kök ve progenitor popülasyonlarının fraksiyonlarını belirlemek için, santrifüj ile hücreleri toplamak ve bir kez 10 de altı hücre ye akış sitometri tampon konsantrasyonu.
Daha sonra, hücreleri 50 mikrolitre aliquots beş mililitre floresan aktif hücre sıralama tüpü deneysel akış sitometri boyama protokolüne göre transfer. Hacim 100 toplam mikrolitreye ayarlayarak hücrelere uygun antikor kokteyli ve canlı/ölü boyamaekleyin. Karanlıkta ışıktan korunan 20 dakika sonra, tüpler başına taze akış sitometri tampon bir mililitre ile hücreleri yıkayın ve tüp başına taze akış sitometri tampon 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra standart akış sitometrik protokollerine göre bir akış sitometre hücreleri analiz. Myeloid soy hücrelerine mikrobead izole CD34 pozitif kök ve progenitor hücreleri ayırt etmek için, ilk kat steril, kaplamasız 48-iyi plaka ile 200 mikrolitre pbs rekombinant insan fibronectin çözeltisi başına oda sıcaklığında iki saat boyunca. Kuluçka sonunda, her kuyudan fibronektin çözeltisini atın ve %2'lik büyükbaş serum albuminin 200 mikrolitresi ile kuyuları kapatın.
Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, kuyuları yıkama başına 500 mikrolitre steril PBS ile iki kez yıkayın. Yeniden beş kez taze izole CD34 pozitif hücreleri askıya 10 sıcak stimülasyon orta konsantrasyon mililitre başına beş hücre. Daha sonra, fibronektin parçası kaplı plakanın her kuyuya 200 mikrolitre hücre tohumu koyun ve plakayı 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kuluçka sonunda, nazik pipetleme ile hücreleri toplamak ve hücre süspansiyon ile yıkar havuz, Dulbecco modifiye Kartal orta ısıtılmış 500 mikrolitre ile kuyuları yıkayın. Sayma sonra, miyeloid diferansiyasyon orta konsantrasyon bir mililitre başına dört hücre için 2,5 kez 10 hücreleri yeniden askıya. Bir MS-5 stromal hücrede iyi başına CD34 pozitif hücrelerin Katman 200 mikrolitre 48 iyi doku kültürü plaka tohumlu.
Daha sonra plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin, her kuyudaki 100 mikrolitre lik süpernatantı her üç ila dört günde bir 100 mikrolitre taze 2X miyeloid farklılaştırma ortamıyla nazikçe değiştirin. 21. günde, akış sitometrisi tarafından miyeloid soy belirteci ekspresyonunun analizi için hücreleri hasat edin. Toplam CD34 pozitif hücrelerin tipik yüzdesi mikrop ayrımı ile kordon kanından izole edildi ve bu CD34 pozitif hücrelerin tipik olarak yaklaşık %20'lik bir soy negatif CD34 pozitif CD34 pozitif CD38 negatif hematopoetik kök hücre popülasyonu ve %72 soyun negatif CD344 pozitif CD38 pozitif multi-güçlü progenitor hücre popülasyonundan oluştuğunu ortaya koymaktadır.
Çok güçlü progenitor hücre popülasyonu içinde, hücrelerin yaklaşık% 25 ortak miyeloid ata belirteçleri ifade, yaklaşık% 15 ekspres granülosit monosit atabelirteci, ve yaklaşık 56% ekspres megakaryosit eritrosit atori belirteçleri. İmmünofetamin, CD34 pozitif hücrelerinin yüzdesinin izolasyonda yaklaşık %90'dan 21. CD34 negatif popülasyonanalizi olgun miyeloid soy belirteçleri ifade hücrelerin yüzdesi eşlik eden bir artış göstermektedir.
Ayrıca, Wright-Giemsa lekeli hücreler büyük, yuvarlak çekirdekler ve çok az sitoplazma sergileyen farklılaşmamış kültürler ve monositler, granülositler ve eritrositler de dahil olmak üzere soy hücrelerinin morfolojik özelliklerini gösteren farklılaşmış kültürler ile birinci ve 21 günlerde farklı morfolojik özellikler gösterirler. Seyreltilmiş kordon kanını katmanları karıştırmadan mononükleer hücre fraksiyonu ortamına dökmeyi unutmayın ve ortamı değiştirirken MS-5 ve CD34 pozitif hücreleri rahatsız etmeyin. Bu farklılaşma protokolünden sonra, CD34 pozitif hücre kültürleri morfolojik değişiklikler, apoptotik etkiler, hücre döngüsü paternlerinde ki değişiklikler ve farklılaşma derecesi açısından analiz edilebilir.
