Este protocolo se puede utilizar para estudiar los cambios moleculares y celulares que se producen durante la diferenciación mieloide normal del tallo hematopoyético positivo CD34 humano y las células progenitoras. La principal ventaja de este protocolo es que permite la diferenciación de células positivas CD34 a lo largo de los cuatro linajes mieloides incluyendo megacariocitos, eritrocitos, granulocitos y monocitos. Demostrando el procedimiento estará Aditi Bapat, un post-doc de mi laboratorio.
Para el aislamiento de células mononucleares de una muestra de sangre de cordón umbilical humano, esterilizar la superficie externa de una bolsa de sangre de cordón umbilical con 70% etanol antes de transferir el contenido de la bolsa a una botella de plástico estéril de 250 mililitros dentro de un gabinete de seguridad biológica. Diluir la sangre con un volumen igual de la solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente, y añadir 15 mililitros de medio de fraccionamiento celular mononuclear a cada uno de los cinco tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Después de una mezcla suave, vierta cuidadosamente 30 mililitros de la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento mononuclear en cada tubo, sosteniendo los tubos de 50 mililitros en un ángulo para ayudar a evitar mezclar las capas.
Separe las células por centrifugación de gradiente de densidad, y retire los 15 a 20 mililitros superiores de plasma por encima de la capa de célula mononuclear. Utilice una pipeta para transferir cuidadosamente la capa de celda mononuclear expuesta a un nuevo tubo de 50 mililitros, juntando las células mononucleares de dos a tres tubos juntos, y lleve el volumen final en cada tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE frío. Pele el mononuclear de las muestras de células por centrifugación, y aspirar a los sobrenadantes.
Toque suavemente cada tubo para aflojar los pellets de la célula y diluir los pellets en cinco mililitros de tampón PBE helado. Combine las células de tres a cuatro tubos en un tubo cónico de 50 mililitros, y lave todos los tubos con cinco mililitros de tampón PBE fresco para recoger las células restantes. Después de contar, traiga el volumen final en el tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE helado fresco, y recoja las células por centrifugación.
Para aislar las células mononucleares positivas CD34, vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de tampón PBE fresco antes de recoger las células con otra centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, toque suavemente para aflojar el pellet y vuelva a suspender las células en una de las 10 a las ocho células mononucleares por cada 300 microlitros de concentración de Tampón PBE helada. Bloquee cualquier unión inespecífica con 100 microlitros del reactivo de bloqueo del receptor Fc, mezcle suavemente y luego agregue 100 microlitros de microperlas CD34 de un kit de micropera CD34 humano de clasificación celular activado magnética por uno por 10 a las ocho células con mezcla suave, e incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.
Mientras las células están incubando, coloque una columna LS y un filtro de preseparación en un campo magnético separador MACS. Equilibre la columna con dos mililitros de tampón PBE helado y el filtro de preseseleccionado con un mililitro de tampón. Deje que la columna se vacíe en un tubo cónico de 15 mililitros y deseche el flujo a través.
Al final de la incubación, llevar el volumen final de la muestra de célula mononuclear hasta 15 mililitros con lúxifado PBE frío fresco y sedimentar las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón PBE helado y cargue las células en el filtro de preseselección en la columna. Enjuague el tubo con tres mililitros de tampón PBE frío y añada el tampón al filtro de presegueta.
Lave la columna cuatro veces con otros tres mililitros de tampón de PBE helado por lavado sin el filtro, lo que permite que la columna drene completamente entre cada lavado. Después del lavado final, mueva la columna a un nuevo tubo de 15 mililitros y sumerja cinco mililitros de PBE frío fresco a través de la columna en el tubo. Para determinar las fracciones de las poblaciones de tallo y progenitor en el recién aislado CD34 positivo células madre y progenitora, recoger las células por centrifugación y re-suspender el pellet en un uno veces 10 a las seis células por cada 50 microlitros de concentración de tampón de citometría de flujo.
A continuación, transfiera las células en 50 alícuotas de microlitros por tubo de clasificación celular activado por fluorescencia de cinco mililitros de acuerdo con el protocolo experimental de tinción de citometría de flujo. Agregue el cóctel de anticuerpos adecuado y la tinción viva/muerta a las células, ajustando el volumen a 100 microlitros totales. Después de 20 minutos en la oscuridad protegido de la luz, lave las células con un mililitro de tampón de citometría de flujo fresco por tubo, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de citometría de flujo fresco por tubo.
Luego analice las células en un citometro de flujo de acuerdo con los protocolos citométricos de flujo estándar. Para diferenciar las células positivas CD34 aisladas de microperla en células de linaje mieloide, cubra primero los pozos de una placa estéril de 48 pozos sin recubrimiento con 200 microlitros por pozo de solución de fibronectina humana recombinante en PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, deseche la solución de fibronectina de cada pozo y bloquee los pozos con 200 microlitros de albúmina sérica 2%bovina.
Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los pozos dos veces con 500 microlitros de PBS estériles por lavado. Re-suspender las células positivas CD34 recién aisladas a cinco veces 10 las cinco células por mililitro de concentración media de estimulación caliente. A continuación, sembrar 200 microlitros de células en cada pozo de la placa recubierta de fragmento de fibronectina y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.
Al final de la incubación, recoger las células con pipeteo suave, y lavar los pozos con 500 microlitros de caliente Dulbecco modificado Medio Eagle, la agrupación de los lavados con la suspensión celular. Después de contar, vuelva a suspender las células a una concentración media de diferenciación de 2,5 veces 10 por mililitro de mieloide. Microlitros de capa 200 de células positivas CD34 por pozo en una placa de cultivo de tejido MS-5 sembrada de células estromales 48 pozos.
A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular, reemplazando suavemente 100 microlitros del sobrenadante en cada pozo con 100 microlitros de medio de diferenciación mieloide 2X fresco cada tres a cuatro días. En el día 21, cosecha las células para el análisis de la expresión del marcador de linaje mieloide por citometría de flujo como se acaba de demostrar. El porcentaje típico de células positivas CD34 totales aisladas de la sangre del cordón umbilical por separación de microperas, como lo demuestra, oscila entre el 80 y el 90%Análisis inmunofenotípico revela que estas células positivas CD34 suelen consistir en una población de células madre hematopoyéticas positivas CD38 CD38 positivas de aproximadamente 20%linaje y una población de células madre vugeno positiva CD38.
Dentro de la población multitenidor de células progenitoras, alrededor del 25% de las células expresan marcadores comunes de progenitores mieloides, alrededor del 15% marcadores de progenitor de monocitos de granulocitos expresos, y alrededor del 56% expresan marcadores de progenitor de megacariocitos eritroideos exprés. El inmunofenotipado también demuestra que el porcentaje de células positivas CD34 reduce de aproximadamente 90%en aislamiento a menos del 25% en el día 21. El análisis de la población negativa CD34 demuestra un aumento concomitante en el porcentaje de células que expresan marcadores de linaje mieloide maduros.
Además, las células manchadas Wright-Giemsa demuestran características morfológicas distintas en los días uno y 21 con los cultivos indiferenciados que exhiben núcleos grandes y redondos y muy poco citoplasma y los cultivos diferenciados que muestran características morfológicas de las células de linaje, incluyendo los cuales son monocitos, granulocitos y eritroblastos. Recuerde verter la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento de células mononucleares sin mezclar las capas, y no perturbe las células positivas MS-5 y CD34 al cambiar el medio. Siguiendo este protocolo de diferenciación, los cultivos celulares positivos CD34 se pueden analizar en busca de cambios morfológicos, efectos apoptóticos, cambios en los patrones de ciclo celular y el grado de diferenciación.
