تشكيل الخلايا الخلايا المعتمية الإنسان على أفلام الشيتوسان

هذا هو بروتوكول مفصل من زراعة الخلايا الرباط اللثة spheroids من قبل أفلام الشيتوزان. بالمقارنة مع نظام الثقافة التقليدية، ينتج نظام ثقافة الزفير خلايا الرباط اللثة مع زيادة تجديد الذات وقدرات التمايز العظمية. للبدء، أعد محلول الشيتوزان من وزن إلى حجم 1٪ حسب التوجيهات في المخطوطة.

إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الشيتوزان في كل بئر من 24 بئرا زراعة الأنسجة البوليسترين لوحة. جفف الطبق في فرن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتكوين أفلام الشيتوسان. لتحييد أفلام الشيتوسان، أضف 0.5 ملليلتر من هيدروكسيد الصوديوم العادي 0.5 إلى كل بئر من الصفيحة التي تحتوي على 24 بئرًا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

ثم، غسل أفلام الشيتوزان ثلاث مرات مع الماء المقطر مزدوجة. تعقيم تشيتوسان المغلفة 24-جيدا لوحة في 70٪ الكحول بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. شطف لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ثم تركها تحت الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.

قبل بذر الخلية، قبل الدافئة انتشار المتوسطة، برنامج تلفزيوني الحل، وحل EDTA التربسين إلى 37 درجة مئوية. تجاهل المافق من قارورة زراعة الخلية وغسل الرباط اللثة اخلط، أو خلايا PDL، مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من محلول تريبسين EDTA إلى القارورة.

احتضان القارورة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ثم إضافة ثلاثة ملليلتر من متوسطة الانتشار لإنهاء عملية الهضم التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ثم الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة ز. تجاهل المتراكب وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من وسيط الانتشار.

عد الخلايا مع قياس الهيموسيت وبذرها على لوحة في خمسة، 10، 30، و 60 ألف خلية في سنتيمتر مربع. زراعة خلايا PDL في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون والهواء المرطب، وتغيير المتوسطة الثقافة مرتين في الأسبوع. مراقبة مورفولوجيا الخلية يوميا لمدة خمسة أيام عبر المجهر النقيض المرحلة العكسية.

يتم تشكيل خلايا PDL القابلة للتطبيق بنجاح باستخدام هذا البروتوكول. نادرا ما لوحظت السفئيدات لكثافة البذر المنخفض في الأيام الأولى وثلاثة. ولكن في اثنين من الكثافات العليا، أحجام مختلفة من spheroids موجودة من اليوم الأول.

كثافة البذر الأمثل هي 30 ألف خلية لكل سنتيمتر مربع لأنها تؤدي إلى ثيرويدات متجانسة. بعد خمسة أيام من الثقافة ، يتم ملاحظة الـ ثيرويدات أكبر لجميع كثافات البذر. يوضح الفحص أن غالبية خلايا PDL على قيد الحياة في الأيام الأولى والثلاثة والسادسة ، ولكن عدد الخلايا الميتة يزيد في اليوم السادس.

أحد قيود هذا البروتوكول هو انخفاض انتشار الخلايا بعد تشكيل spheroid. لذلك هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتعزيز انتشار الخلايا بعد تشكيل الزفير.