Questo è un protocollo dettagliato di coltivare sferoidi cellulari legamento parodontali da pellicole chitosane. Rispetto al sistema di coltura convenzionale, il sistema di coltura sferoide produce cellule legamentose parodontali con maggiori capacità di autori rinnovamento e differenziazione osteogenica. Per iniziare, preparare una soluzione chitosa peso-volume dell'1% come indicato nel manoscritto.
Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione chitosana in ogni pozzo di una piastra di polistirene coltura tissutale a 24 pozzo. Asciugare il piatto in un forno a 60 gradi Celsius per 24 ore per formare pellicole chitosane. Per neutralizzare le pellicole chitosane, aggiungere 0,5 millilitri di idrossido di sodio normale 0,5 ad ogni pozzo della piastra da 24 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per due ore.
Quindi, lavare le pellicole chitosane tre volte con acqua doppia distillata. Sterilizzare la piastra da 24 pozzi rivestita di chitosano con alcool al 70% durante la notte a temperatura ambiente. Risciacquare la piastra tre volte con PBS, quindi lasciarla sotto la luce ultravioletta durante la notte.
Prima della semina cellulare, mezzo di proliferazione pre-caldo, soluzione PBS e soluzione EDTA di tripina a 37 gradi Celsius. Scartare il supernatante dal pallone di coltura cellulare e lavare il legamento parodontale confluente, o cellule PDL, con 10 millilitri di PBS. Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione DI EDTA di tripina al pallone.
Incubare il pallone a 37 gradi Celsius per tre minuti e quindi aggiungere tre millilitri di mezzo di proliferazione per terminare la digestione della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri, quindi centrifugarla per cinque minuti a 300 volte g. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 500 microlitri di mezzo di proliferazione.
Contare le cellule con un emocitometro e seminarle sulla piastra a cinque, 10, 30 e 60 mila cellule per centimetro quadrato. Coltura delle cellule PDL in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e aria umidificata, cambiando il mezzo di coltura due volte a settimana. Osserva la morfologia cellulare ogni giorno per cinque giorni tramite un microscopio a contrasto di fase inversa.
Gli sferoidi cellulari PDL vitali si formano correttamente utilizzando questo protocollo. Gli sferoidi sono raramente osservati per la densità di semina inferiore nei giorni uno e tre. Ma alle due densità più elevate, varie dimensioni di sferoidi sono presenti fin dal primo giorno.
La densità di semina ottimale è di 30 mila cellule per centimetro al quadrato perché si traduce in sferoidi omogenei. Dopo cinque giorni di coltura, si osservano sferoidi più grandi per tutte le densità di semina. Un saggio di vitalità dimostra che la maggior parte delle cellule PDL sono vive nei giorni uno, tre e sei, ma il numero di cellule morte aumenta il sesto giorno.
Una limitazione di questo protocollo è la diminuzione della proliferazione delle cellule dopo la formazione di sferoidi. Sono quindi necessari ulteriori studi per promuovere la proliferazione delle cellule dopo la formazione di sferoidi.
