Il s’agit d’un protocole détaillé de la culture des sphéroïdes des cellules ligamentaires parodontale par des films chitosan. Comparé au système conventionnel de culture, le système de culture sphéroïde produit des cellules parodontales de ligament avec des capacités accrues d’auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique. Pour commencer, préparez une solution chitosan de 1 % de poids par rapport au volume, tel que dirigé dans le manuscrit.
Ajouter 0,5 millilitres de solution chitosan dans chaque puits d’une plaque de polystyrène de culture tissulaire de 24 puits. Séchez la plaque dans un four à 60 degrés Celsius pendant 24 heures pour former des films chitosan. Pour neutraliser les films chitosan, ajouter 0,5 millilitres d’hydroxyde de sodium normal à chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber à température ambiante pendant deux heures.
Ensuite, lavez les films chitosan trois fois avec de l’eau double-distillée. Stériliser la plaque de 24 puits recouverte de chitosan dans 70% d’alcool pendant la nuit à température ambiante. Rincez la plaque trois fois avec du PBS puis laissez-la sous la lumière ultraviolette pendant la nuit.
Avant l’ensemencement cellulaire, le milieu de prolifération préchauffé, la solution PBS et la solution trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Jetez le supernatant de la fiole de culture cellulaire et lavez le ligament parodontal confluent, ou cellules PDL, avec 10 millilitres de PBS. Jetez le PBS et ajoutez un millilitre de solution trypsine EDTA au flacon.
Incuber le flacon à 37 degrés Celsius pendant trois minutes, puis ajouter trois millilitres de milieu de prolifération pour mettre fin à la digestion de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres, puis la centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois g. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 500 microlitres de milieu de prolifération.
Comptez les cellules avec un hémocytomètre et ensemencez-les sur la plaque à cinq, 10, 30 et 60 mille cellules par centimètre carré. Culture des cellules PDL dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone et d’air humidifié, en changeant le milieu de culture deux fois par semaine. Observez la morphologie cellulaire quotidiennement pendant cinq jours au moyen d’un microscope à contraste de phase inverse.
Des sphéroïdes cellulaires PDL viables sont formés avec succès à l’aide de ce protocole. Les sphéroïdes sont rarement observés pour la densité d’ensemencement inférieure les jours un et trois. Mais aux deux densités plus élevées, différentes tailles de sphéroïdes sont présentes dès le premier jour.
La densité optimale d’ensemencement est de 30 mille cellules par centimètre au carré parce qu’elle entraîne des sphéroïdes homogènes. Après cinq jours de culture, de plus grands sphéroïdes sont observés pour toutes les densités d’ensemencement. Un test de viabilité démontre que la majorité des cellules PDL sont vivantes les jours un, trois et six, mais le nombre de cellules mortes augmente le sixième jour.
Une limitation de ce protocole est la prolifération diminuée des cellules après formation de sphéroïdes. Ainsi, d’autres études visant à promouvoir la prolifération des cellules après la formation de sphéroïdes sont nécessaires.
