Bu, chitosan filmlerinin periodontal ligament hücre sferoidlerinin kültürlenmesinin ayrıntılı bir protokolüdür. Konvansiyonel kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, küresel kültür sistemi artmış kendini yenileme ve osteojenik farklılaşma yetenekleri ile periodontal ligament hücreleri üretir. Başlamak için, el yazmasında belirtildiği gibi %1 ağırlık-to-volume chitosan çözeltisi hazırlayın.
24 kuyulu doku kültürü polistiren plakanın her kuyuya 0,5 mililitre chitosan çözeltisi ekleyin. Chitosan filmleri oluşturmak için plakayı 60 derecede 24 saat boyunca fırında kurutun. Chitosan filmlerini nötralize etmek için, 24 kuyulu plakanın her kuyusuna 0,5 mililitre normal sodyum hidroksit ekleyin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Daha sonra chitosan filmlerini üç kez çift distile suyla yıkayın. Chitosan kaplı 24 kuyulu tabağı oda sıcaklığında bir gecede %70 alkolle sterilize edin. Plakayı PBS ile üç kez durulayın ve bir gecede ultraviyole ışık altında bırakın.
Hücre tohumlama önce, pre-Sıcak proliferasyon orta, PBS çözeltisi, ve 37 santigrat derece trypsin EDTA çözeltisi. Hücre kültürü şişesinden supernatant atın ve pbs 10 mililitre ile, confluent periodontal ligament veya PDL hücreleri yıkayın. PBS atın ve şişeye bir mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.
Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika kuluçkaya yatırın ve tripsin sindirimini sonlandırmak için üç mililitre proliferasyon ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir tüp aktarın ve sonra 300 kez g beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve çoğalma orta 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Bir hemositometre ile hücreleri saymak ve santimetre kare başına beş, 10, 30 ve 60 bin hücre plaka üzerine tohum. Kültür pdl hücreleri bir kuvöz de 37 santigrat santigrat 5% karbondioksit ve nemlendirilmiş hava, haftada iki kez kültür ortamı değişen. Ters faz kontrast mikroskobu ile beş gün boyunca günlük hücre morfolojisini gözlemleyin.
Canlı PDL hücre spheroidleri bu protokol kullanılarak başarıyla oluşturulur. Spheroidler nadiren birinci ve üçüncü günlerde alt tohumlama yoğunluğu için gözlenir. Ama iki yüksek yoğunlukta, ilk günden itibaren çeşitli boyutlarda küresel ler bulunur.
Homojen küresel balıklarla sonuçlandığı için en uygun tohumlama yoğunluğu santimetre karebaşına 30 bin hücredir. Kültür beş gün sonra, büyük küresel ler tüm tohumlama yoğunlukları için gözlenmektedir. Canlılık telbette, PDL hücrelerinin çoğunun birinci, üçüncü ve altıncı günlerde canlı olduğunu gösterir, ancak ölü hücre sayısı altıncı günde artar.
Bu protokolün bir sınırlama küresel oluşumu ndan sonra hücrelerin çoğalması azalmış olmasıdır. Bu nedenle, küresel oluşumdan sonra hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek için daha ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir.
