Este é um protocolo detalhado de cultivo de esferoides de células ligamentares periodontais por filmes quitosanos. Comparado com o sistema de cultura convencional, o sistema de cultura esferoide produz células do ligamento periodontal com maior autoconexão e capacidades de diferenciação osteogênica. Para começar, prepare a solução chitosana de peso para volume de 1%, conforme indicado no manuscrito.
Adicione 0,5 mililitros de solução de chitosan em cada poço de uma placa de poliestireno de cultura tecidual de 24 poços. Seque a placa em um forno a 60 graus Celsius durante 24 horas para formar filmes de chitosan. Para neutralizar os filmes de chitosan, adicione 0,5 mililitros de hidróxido de sódio normal de 0,5 a cada poço da placa de 24 poços e incubar à temperatura ambiente por duas horas.
Em seguida, lave os filmes de chitosan três vezes com água duplamente destilada. Esterilize a placa de 24 poços revestida de quitosan em 70% de álcool durante a noite à temperatura ambiente. Enxágüe a placa três vezes com PBS e deixe-a sob luz ultravioleta durante a noite.
Antes da semeadura celular, meio de proliferação pré-quente, solução PBS e solução EDTA de trippsina a 37 graus Celsius. Descarte o supernascedor do frasco de cultura celular e lave o ligamento periodontal confluente, ou células PDL, com 10 mililitros de PBS. Descarte o PBS e adicione um mililitro de solução EDTA de trippsina ao frasco.
Incubar o frasco a 37 graus Celsius por três minutos e, em seguida, adicionar três mililitros de meio de proliferação para terminar a digestão de trippsina. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e depois centrífuga por cinco minutos a 300 vezes g. Descarte o supernascer e suspenda as células em 500 microliters de meio de proliferação.
Conte as células com um hemócito e semee-as na placa a cinco, 10, 30 e 60 mil células por centímetro quadrado. Cultura as células PDL em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e ar umidificado, mudando o meio cultural duas vezes por semana. Observe a morfologia celular diariamente por cinco dias através de um microscópio de contraste de fase inversa.
Esferoides viáveis de células PDL são formados com sucesso usando este protocolo. Esferoides raramente são observados para a densidade de menor semeadura nos dias um e três. Mas nas duas densidades mais altas, vários tamanhos de esferoides estão presentes desde o primeiro dia.
A densidade ideal de semeadura é de 30 mil células por centímetro quadrado porque resulta em esferoides homogêneos. Após cinco dias de cultura, spheróides maiores são observados para todas as densidades de semeadura. Um ensaio de viabilidade demonstra que a maioria das células PDL estão vivas nos dias um, três e seis, mas o número de células mortas aumenta no sexto dia.
Uma limitação deste protocolo é a diminuição da proliferação de células após a formação de esferoides. Assim, são necessários mais estudos para promover a proliferação de células após a formação de esferoides.
