Formación de esferoides de células de ligamento periodontal humano en Chitosan Films

Este es un protocolo detallado de cultivo de esferoides de células de ligamentos periodontales por películas de quitosano. En comparación con el sistema de cultivo convencional, el sistema de cultivo de esferoides produce células de ligamentos periodontales con mayor capacidad de auto-renovación y diferenciación osteogénica. Para empezar, prepare una solución de quitosano de 1%peso a volumen como se indica en el manuscrito.

Añadir 0,5 mililitros de solución de quitosano en cada pocódica de 24 pocillos de cultivo de tejido. Seque el plato en un horno a 60 grados centígrados durante 24 horas para formar películas de quitosano. Para neutralizar las películas de quitosano, añadir 0,5 mililitros de 0,5 hidróxido de sodio normal a cada pozo de la placa de 24 pozos e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.

A continuación, lave las películas de quitosano tres veces con agua doble destilada. Esterilice el plato de 24 pozos recubierto de quitosano en 70% de alcohol durante la noche a temperatura ambiente. Enjuague la placa tres veces con PBS y déjela bajo luz ultravioleta durante la noche.

Antes de la siembra celular, medio de proliferación pre-cálido, solución PBS y solución EDTA de trippsa a 37 grados Celsius. Deseche el sobrenadante del matraz de cultivo celular y lave el ligamento periodontal confluente, o células PDL, con 10 mililitros de PBS. Deseche el PBS y agregue un mililitro de solución EDTA de trippsina al matraz.

Incubar el matraz a 37 grados centígrados durante tres minutos y luego añadir tres mililitros de medio de proliferación para terminar la digestión de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y luego centrifugarlo durante cinco minutos a 300 g. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 500 microlitros de medio de proliferación.

Cuente las células con un hemocitoómetro y se las semilla en la placa a cinco, 10, 30 y 60 mil células por centímetro cuadrado. Cultivo de las células PDL en una incubadora a 37 grados Celsius en 5%dióxido de carbono y aire humidificado, cambiando el medio de cultivo dos veces por semana. Observar la morfología celular diariamente durante cinco días a través de un microscopio de contraste de fase inversa.

Los esferoides de células PDL viables se forman con éxito utilizando este protocolo. Los esferoides rara vez se observan para la densidad de siembra inferior en los días uno y tres. Pero en las dos densidades más altas, varios tamaños de esferoides están presentes desde el primer día.

La densidad óptima de siembra es de 30 mil células por centímetro cuadrado porque resulta en esferoides homogéneos. Después de cinco días de cultivo, se observan esferoides más grandes para todas las densidades de siembra. Un ensayo de viabilidad demuestra que la mayoría de las células PDL están vivas en los días uno, tres y seis, pero el número de células muertas aumenta en el sexto día.

Una limitación de este protocolo es la disminución de la proliferación de células después de la formación de esferoides. Por lo tanto, se requieren más estudios para promover la proliferación de células después de la formación de esferoides.