キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

キトサンフィルムによる歯周靭帯細胞スフェロイドの培養の詳細なプロトコルです。従来の培養システムと比較して、スフェロイド培養システムは、自己再生能力および骨形成分化能力を有する歯周靭帯細胞を産生する。まず、原稿の指示に従って1%重量から容積のキトサン溶液を準備します。

24ウェル組織培養ポリスチレンプレートの各ウェルに0.5ミリリットルのキトサン溶液を加えます。オーブンで60°Cで24時間乾かしてキトサンフィルムを形成します。キトサンフィルムを中和するには、24ウェルプレートのウェルに0.5標準水酸化ナトリウムを0.5ミリリットル加え、室温で2時間インキュベートします。

その後、キトサンフィルムを二重蒸留水で3回洗います。キトサンコーティング24ウェルプレートを室温で一晩70%アルコールで殺菌する。PBSでプレートを3回リンスし、一晩紫外線の下に放置します。

細胞播種前、プリウォーム増殖培地、PBS溶液、およびトリプシンEDTA溶液を摂氏37度にする。細胞培養フラスコから上清を捨て、10ミリリットルのPBSでコンフルエント歯周靭帯(PDL細胞)を洗浄します。PBSを捨て、フラスコにトリプシンEDTA溶液を1ミリリットル加えます。

フラスコを37°Cで3分間インキュベートし、3ミリリットルの増殖培地を加えてトリプシン消化を終了します。細胞懸濁液を15ミリリットル円錐形チューブに移し、それを300回gで5分間遠心分離する。上清を捨て、増殖培地の500マイクロリットルで細胞を再懸濁する。

血球計で細胞を数え、5、10、30、および60千の細胞/平方センチメートルでプレートに播種します。PDL細胞を摂氏37度で5%炭酸ガスと加湿空気で培養し、週2回培地を交換する。逆相コントラスト顕微鏡で、細胞形態を毎日5日間観察します。

実行可能なPDL細胞スフェロイドは、このプロトコルを使用して正常に形成されます。スフェロイドは、1日目と3日目の低播種密度ではめったに観察されません。しかし、2つの高密度では、1日目から様々なサイズのスフェロイドが存在します。

最適な播種密度は、均質な回転楕円体をもたらすため、30,000セル/センチメートル平方メートルです。培養の5日後、より大きなスフェロイドは、すべての播種密度のために観察される。生存アッセイは、PDL細胞の大部分が1日目、3日目、6日目に生きているが、死んだ細胞の数は6日目に増加することを示している。

このプロトコルの1つの制限は、スフェロイド形成後の細胞の増殖減少である。そこで、スフェロイド形成後の細胞の増殖を促進するためのさらなる研究が必要とされている。