Формирование сферонтальных связок человека сфероиды на chitosan Фильмы

Это подробный протокол культивирования пародонтальной связки клеток сфероидов хитозаном фильмов. По сравнению с обычной системой культуры, система сфероидной культуры производит клетки пародонтальной связки с повышенной самообувечиваемой и остеогенной дифференциацией способностей. Для начала подготовьте 1%-ный к объему хитозан решение, как указано в рукописи.

Добавьте 0,5 миллилитров раствора хитозана в каждую колодец из 24-хорошо ткани культуры полистирол пластины. Высушите тарелку в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24 часов, чтобы сформировать хитозановые пленки. Чтобы нейтрализовать хитозановые пленки, добавьте 0,5 миллилитров 0,5 нормального гидроксида натрия к каждой пластине из 24-хорошо и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов.

Затем трижды мыть хитозанные пленки двойной дистиллированной водой. Стерилизовать хитозан покрытием 24-хорошо пластины в 70% алкоголя на ночь при комнатной температуре. Промыть пластину три раза с PBS затем оставить его под ультрафиолетовым светом на ночь.

До посева клеток, предварительно теплой среды пролиферации, pbs решение, и трипсин EDTA решение до 37 градусов по Цельсию. Отбросьте супернатант из колбы клеточной культуры и вымойте слияние пародонтальной связки, или PDL клеток, с 10 миллилитров PBS. Откажитесь от PBS и добавьте один миллилитр трипсина EDTA решение колбы.

Инкубировать колбу при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут, а затем добавить три миллилитров среды пролиферации, чтобы прекратить пищеварение трипсина. Передача клеточной подвески в 15 миллилитров конической трубки затем центрифуга его в течение пяти минут при 300 раз г. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 500 микролитров среды пролиферации.

Подсчитайте клетки с гемоцитометром и посеять их на пластину на 5, 10, 30 и 60 тысяч клеток на квадратный сантиметр. Культура PDL клеток в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа и увлажненные воздуха, изменение культуры среды два раза в неделю. Наблюдайте морфологию клетки ежедневно на 5 дней через обратный микроскоп контраста фазы.

С помощью этого протокола успешно образуются жизнеспособные сфероиды клеток PDL. Сфероиды редко наблюдаются для более низкой плотности посева в дни один и три. Но при двух более высоких плотностях, различные размеры сфероидов присутствуют с первого дня.

Оптимальная плотность посева составляет 30 тысяч клеток в квадрате, так как приводит к однородным сфероидам. После пяти дней культуры, большие сфероиды наблюдаются для всех плотностей посева. Анализ жизнеспособности показывает, что большинство клеток PDL живы в дни один, три и шесть, но число мертвых клеток увеличивается на шестой день.

Одним из ограничений этого протокола является снижение пролиферации клеток после образования сфероидов. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для содействия распространению клеток после образования сфероидов.