היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

זהו פרוטוקול מפורט של כדוריות רצועה חניכיים culturing על ידי סרטי chitosan. בהשוואה למערכת התרבות הקונבנציונלית, מערכת התרבות הכדורית מייצרת תאי רצועה חניכיים עם התחדשות עצמית מוגברת ויכולות בידול אוסטאוגניות. ראשית, הכינו פתרון צ'יטוסאן במשקל של 1% לפי ההנחיות בכתב היד.

הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון chitosan לתוך כל באר של צלחת פוליסטירן תרבות רקמות 24 היטב. יבש את הצלחת בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי ליצור סרטי צ'יטוסאן. כדי לנטרל את סרטי chitosan, להוסיף 0.5 מיליליטר של 0.5 הידרוקסיד נתרן נורמלי לכל באר של צלחת 24 באר דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.

לאחר מכן, לשטוף את סרטי chitosan שלוש פעמים עם מים מזוקקים פעמיים. יש לעקר את צלחת ה-24 בארות מצופה הצ'יטוסאן ב-70% אלכוהול במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS ואז להשאיר אותו תחת אור אולטרה סגול לילה.

לפני זריעת תאים, מדיום התפשטות טרום חם, פתרון PBS, ו פתרון EDTA טריפסין ל 37 מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי מבקבוק תרבות התאים ושטפו את הרצועה חניכיים, או תאי PDL, עם 10 מיליליטר של PBS. השלך את PBS והוסף מיליליטר אחד של פתרון EDTA טריפסין לבקבוק.

דגירה הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום התפשטות כדי לסיים את העיכול טריפסין. מעבירים את ההשעיה התא לצינור חרוט 15 מיליליטר ואז צנטריפוגה זה במשך חמש דקות ב 300 פעמים g. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות.

לספור את התאים עם hemocytometer ולזרע אותם על הצלחת בחמש, 10, 30, ו 60 אלף תאים לס"מ מרובע. תרבות תאי PDL באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני ואוויר לח, שינוי מדיום התרבות פעמיים בשבוע. שימו לב למורפולוגיה של התא מדי יום במשך חמישה ימים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה.

כדוריות תא PDL קיימא נוצרים בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. כדורידים נצפו לעתים רחוקות עבור צפיפות זריעה נמוכה יותר בימים 1 ו -3. אבל בשתי הצפיפות הגבוהה יותר, גדלים שונים של כדוריות נוכחים מהיום הראשון.

צפיפות הזריעה האופטימלית היא 30 אלף תאים לס"מ בריבוע מכיוון שהיא גורמת לספרואידים הומוגניים. לאחר חמישה ימים של תרבות, כדוריות גדולות יותר נצפו עבור כל צפיפות הזריעה. מראיה של כדאיות מוכיחה שרוב תאי ה-PDL חיים בימים 1, 3 ו-6, אבל מספר התאים המתים עולה ביום השישי.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא ירידה בהתפשטות של תאים לאחר היווצרות ספרואיד. אז מחקרים נוספים כדי לקדם את התפשטות של תאים לאחר היווצרות ספרואיד נדרשים.