طريقتنا هي واحدة من أول من يكون قادرا على تشريح الأسس الوراثية للاختلافات سمة على نطاق الجينوم بين الأنواع بدلا من داخل الأنواع. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه عالي الإنتاجية، وارتفاع القرار، وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. لبدء هذا الإجراء، استرداد سلالة مخزون الفريزر JR507 من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية، و streak بها إلى مستعمرات واحدة على لوحة YPD أجار.
احتضان في 26 درجة مئوية لمدة يومين أو حتى تظهر المستعمرات. ثم تلقيح 100 ملليلتر من YPD السائل في قارورة زجاجية 250 ملليلتر مع مستعمرة واحدة من JR507، واحتضان في 28 درجة مئوية في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة أو حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. في اليوم التالي، وقياس od600 من ثقافة بين عشية وضحاها.
مرة أخرى تمييع بعض من ثقافة بين عشية وضحاها مع YPD السائل الطازج في قارورة لتر واحد جديد لخلق ثقافة جديدة مع od600 من نقطة الصفر اثنين وحجم 500 ملليلتر. كرر هذه العملية ثلاث مرات أخرى لإنشاء ما مجموعه أربع ثقافات مع od600 من نقطة الصفر اثنين، وذلك باستخدام نفس ثقافة بين عشية وضحاها لجميع الثقافات الجديدة. احتضان جميع الثقافات في 28 درجة مئوية لمدة ست ساعات في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، الجمع بين اثنين من الثقافات 500 ملليلتر لخلق ثقافة لتر واحد. الجمع بين الثقافات المتبقية 500 ملليلتر لخلق ثانية واحدة لتر الثقافة. أولاً، تقسيم كل من الثقافات لتر واحد إلى 20 50 ملليلتر aliquots كل في أنبوب مخروطية البلاستيك لما مجموعه 40 أنابيب.
يُترك 20 أنبوبًا جانباً. أجهزة الطرد المركزي المتبقية 20 أنابيب في 1000 مرات G لمدة ثلاث دقائق ل بيليه خلايا الخميرة. تخلص من المابير، و resuspend كل بيليه مع 25 ملليلتر من الماء المعقم من قبل دوامة.
جهاز طرد مركزي في 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق كل بيليه مع خمسة ملليلتر من 1X تريس-EDTA نقطة صفر واحد حمض الليثيوم خلات العازلة من قبل دوامة. جهاز طرد مركزي في 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق.
تجاهل supernatant، و resuspend كل بيليه مرة أخرى مع خمسة ملليلتر 1X تريس-EDTA نقطة صفر واحد مولار ليثيوم خلات العازلة من قبل دوامة. جهاز طرد مركزي في 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق. في حين أن الخلايا هي الطرد المركزي، وإعداد ما لا يقل عن 120 ملليلتر من محلول يحتوي على غليكول البولي إيثيلين، خلات الليثيوم، وترايس-EDTA العازلة.
تخزين هذا الحل على الجليد. لإعداد الحمض النووي البلازما للتحول، يغلي أولا أربعة ملليلترات من الحمض النووي من الحيوانات المنوية السلمون في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، على الفور تبريده على الجليد لمدة خمس دقائق.
مزيج 20 ملليلتر من pJR487 بتركيز 538 نانوغرام لكل ملليلتر مع أربعة ملليلتر من الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون الباردة. الحفاظ على هذا الخليط على الجليد حتى جاهزة للاستخدام. المقبل، إضافة 600 ميكرولترات من البلازما والحيوانات المنوية خليط الحمض النووي على رأس كل بيليه الخلية.
إضافة ثلاثة ملليلتر من خليط خلات الليثيوم TE PEG إلى كل بيليه. نعلق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ومن ثم دوامة. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
ثم الحرارة صدمة كل أنبوب في حمام مائي في 39 درجة مئوية لمدة 26 دقيقة، والتأكد من عكس كل أنبوب كل بضع دقائق. الطرد المركزي الأنابيب في 1000 مرات G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل افراط، وإعادة تعليق كل بيليه في 10 ملليلتر من YPD من دوامة.
بعد ذلك، الجمع بين جميع الأنابيب 20 في قارورة زجاجية جديدة. إضافة 433 نقطة أربع ملليلتر من YPD السائل في قارورة زجاج لتر واحد جديد. ثم نقل 66 نقطة ستة ملليلتر من الخلايا في القارورة.
كرر هذه العملية نقل مرتين أكثر من ذلك لاستخدام وحدة التخزين الكاملة للخلايا المحولة. ثم قياس od600 من كل ثقافة 500 ملليلتر جديدة. احتضان جميع الثقافات الثلاث في 28 درجة مئوية لمدة ساعتين في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
بعد هذا إضافة نقطة الصفر خمس ملليلتر من 300 ملليغرام لكل ميكرولتر G418 إلى كل من القارورة إلى تركيز النهائي من 300 ميكروغرام لكل ملليلتر. أعيدوا القارورة إلى حاضنة الهز عند درجة حرارة 28 درجة مئوية و200 لفة في الدقيقة. كرر هذه العملية بأكملها مع أنابيب المخروطية المتبقية 20.
عند هذه النقطة، يجب أن يكون هناك ستة قارورة لتر واحد، كل تحتوي على 500 ملليلتر من الخلايا مع G418 وأضاف. احتضان جميع القارورة الستة عند درجة 28 مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة يومين تقريبا أو حتى يتم التوصل إلى od600 من حوالي نقطتين ثلاث نقاط في كل قارورة. ثم، والجمع بين جميع القوارير الستة معا لخلق ثقافة واحدة.
استخدام هذه الثقافة مجتمعة لتطعيم اثنين من قارورة لتر واحد جديد مع 500 ملليلتر من YPD وG418 إلى od600 من صفر نقطة اثنين. احتضان هذه الثقافات الجديدة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى od600 من ما يقرب من نقطتين. بعد هذا, ضمّ كلا ثقافات داخل ثقافة وحيدة, ويقيّس ال 600 من الثقافة مجتمعة.
جهاز طرد مركزي 25 ملليلتر من هذه الثقافة في 1000 مرات G لمدة ثلاث دقائق. حساب عدد وحدات od600 الإجمالي من الخلايا الموجودة في 25 ملليلتر كما هو موضح في بروتوكول النص. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في ما يكفي من الماء لإنشاء تعليق الخلية مع od600 من نقطة واحدة ثمانية خمسة لكل ملليلتر.
باستخدام الخرز الزجاجي، لوحة ملليلتر واحد من الخلايا resuspended على كل من 12 كبيرة، مربع كامل لوحات أجار الاصطناعية مع 5-FOA. احتضان كل لوحة في 28 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين، أو حتى أشكال العشب على لوحة. بعد ذلك ، استخدم ممسحات صغيرة معقمة لتخريد الخلايا من نصف اللوحة ، وإلى أنبوب ، يحتوي على 35 ملليلتر من الماء المعقم.
كرر هذه العملية للوحات الستة المتبقية، مما يؤدي إلى أنبوبين من الخلايا في الماء. الجمع بين تعليق الخلية في قارورة واحدة، وقياس od600 من التعليق، وذلك باستخدام الماء كفراغ. استخدم الماء لضبط تركيز الخلايا حتى يصل od600 إلى 44 نقطة في المليلتر.
بعد ذلك، إعداد مخزونات الفريزر من الخلايا وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، S.Cerevisiae وS.Paradoxus هي تزاوج لتشكيل هجين العقيمة، التي تتعرض لنقل على الطفرات. كل استنساخ مُطَرَّع هو هيميزغوت، وهو هجين ثنائي الوَرَك يُخلَّع فيه أحد الجينات.
يتنافس الهزيمزغوت في درجة حرارة عالية ، ويتم عزل الحمض النووي عن كل ثقافة. يتم قذف الحمض النووي وربطه بالمحولات، ويتم تضخيم الوصلة بين النابر والجينوم مع التمهيدي الخاص بالنابر والناوين. عد معظم تسلسل قراءة التهم من amplicon ، تقرير عن اللياقة البدنية لاستنساخ في السكان.
مع النتائج في متناول اليد من هذا التسلسل، وفرة hemizygote لجين معين، يمكن مقارنة في درجات الحرارة بين فئتين من الهزيمزغوت. استنساخ حيث فقط أليل S.Cerevisiae كان من النوع البرية والوظيفية، والمستنسخات تعتمد فقط على أليل S.Paradoxus. في هذا التنفيذ التمثيلي ، يتم الكشف عن إشارات قوية في ثمانية جينات التدبير المنزلي.
في كل حالة, إدراج transposon في أليل S.Cerevisiae في الهجين, للخطر النمو في درجة حرارة عالية. مثلت هذه المنخفضة si محددات المرشح من سمة الحرارة التي تميز S.Cerevisiae من S.Paradoxus. الآن بعد أن أكملنا هذه التجربة، يمكننا تشريح الصفات الأخرى التي تختلف بين هذه الأنواع، مثل التسامح البارد أو الملح.
