Nuestro método es uno de los primeros en poder diseccionar las bases genéticas de las diferencias de rasgo en una escala genómica entre especies en lugar de dentro de especies. Las principales ventajas de esta técnica son que es de alto rendimiento, alta resolución y ampliamente aplicable. Para comenzar este procedimiento, recupere la cepa de stock del congelador JR507 del almacenamiento a menos 80 grados Centígrados, y sáquela a colonias individuales en una placa de agar YPD.
Incubar a 26 grados centígrados durante dos días o hasta que aparezcan las colonias. Luego inocular 100 mililitros de YPD líquido en un matraz de vidrio de 250 mililitros con una sola colonia de JR507, e incubar a 28 grados centígrados mientras se agita a 200 RPM durante 24 horas o hasta que se alcance la fase estacionaria. Al día siguiente, mida el od600 de la cultura de la noche a la mañana.
La espalda diluye parte del cultivo nocturno con YPD líquido fresco en un nuevo matraz de un litro para crear un nuevo cultivo con un od600 de punto cero dos y un volumen de 500 mililitros. Repita este proceso tres veces más para crear un total de cuatro culturas con un od600 de cero punto dos, utilizando la misma cultura nocturna para todas las nuevas culturas. Incubar todos los cultivos a 28 grados centígrados durante seis horas mientras se agita a 200 RPM.
Después de esto, combina dos de los cultivos de 500 mililitros para crear un cultivo de un litro. Combine los dos cultivos de 500 mililitros restantes para crear un segundo cultivo de un litro. En primer lugar, divida cada uno de los cultivos de un litro en 20 alícuotas de mililitros cada uno en un tubo cónico de plástico para un total de 40 tubos.
Reserva 20 tubos. Centrifugar los 20 tubos restantes a 1000 veces G durante tres minutos para peletizar las células de levadura. Deseche el sobrenadante y resuspender cada pellet con 25 mililitros de agua estéril por vórtice.
Centrifugar a 1000 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend cada pellet con cinco mililitros de 1X Tris-EDTA punto cero un tampón de acetato de litio Molar por vórtice. Centrifugar a 1000 veces G durante tres minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspender cada pellet de nuevo con cinco mililitros 1X Tris-EDTA punto cero un tampón de acetato de litio Molar por vórtice. Centrifugar a 1000 veces G durante tres minutos. Mientras las células están centrifugando, prepare al menos 120 mililitros de una solución que contenga polietilenglicol, acetato de litio y tampón Tris-EDTA.
Almacene esta solución en hielo. Para preparar el ADN plasmático para la transformación, primero hierve cuatro mililitros de ADN de espermatozoides de salmón a 100 grados Celsius durante cinco minutos. Después de esto, enfríe inmediatamente sobre hielo durante cinco minutos.
Mezclar 20 mililitros de pJR487 a una concentración de 538 nanogramos por mililitro con cuatro mililitros del ADN de espermatozoides de salmón frío. Mantenga esta mezcla sobre hielo hasta que esté lista para usar. A continuación, agregue 600 microlitros de la mezcla de plasma y ADN de espermatozoides encima de cada pellet celular.
Añadir tres mililitros de la mezcla de acetato de litio PEG TE a cada pellet. Suspendimos en pipeteando arriba y abajo y luego vórtices. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Luego impacta cada tubo en un baño de agua a 39 grados Celsius durante 26 minutos, asegurándote de invertir cada tubo cada pocos minutos. Centrifugar los tubos a 1000 veces G durante tres minutos. Desechar el sobrenadante, y resuspender cada pellet en 10 mililitros de YPD por vórtice.
Después de esto, combine los 20 tubos en un nuevo matraz de vidrio. Agregue 433 mililitros de YPD líquido en un nuevo matraz de vidrio de un litro. A continuación, transfiera 66 mililitros de células a la matraz.
Repita este proceso de transferencia dos veces más para utilizar todo el volumen de celdas transformadas. A continuación, mida el od600 de cada nuevo cultivo de 500 mililitros. Incubar los tres cultivos a 28 grados centígrados durante dos horas mientras se agita a 200 RPM.
Después de esto añadir cero punto cinco mililitros de 300 miligramos por microlitro G418 a cada uno de los matraces a una concentración final de 300 microgramos por mililitro. Devuelva los matraces a la incubadora de agitación a 28 grados centígrados y 200 RPM. Repita todo este proceso con los 20 tubos cónicos restantes.
En este punto, debe haber seis matraces de un litro, cada uno con 500 mililitros de células con G418 añadido. Incubar los seis matraces a 28 grados centígrados con agitación a 200 RPM durante aproximadamente dos días o hasta que se alcance un od600 de aproximadamente dos puntos tres en cada matraz. A continuación, combine los seis matraces para crear un único cultivo.
Utilice este cultivo combinado para inocular dos nuevos matraces de un litro con 500 mililitros de YPD y G418 a un od600 de cero punto dos. Incubar estos nuevos cultivos durante la noche a 28 grados centígrados con temblores a 200 RPM hasta llegar a un od600 de aproximadamente dos puntos dos. Después de esto, combine ambas culturas en una sola cultura, y mida el od600 de la cultura combinada.
Centrifugar 25 mililitros de este cultivo a 1000 veces G durante tres minutos. Calcule el número total de unidades od600 de celdas que se encuentran en los 25 mililitros como se describe en el protocolo de texto. Deseche el sobrenadante y resuspendir las células en suficiente agua para crear una suspensión celular con un od600 de un punto ocho cinco por mililitro.
Usando cuentas de vidrio, plancha un mililitro de células resuspendidas en cada una de las 12 placas de agar sintéticos grandes y cuadradas completas con 5-FOA. Incubar cada plato a 28 grados centígrados durante uno o dos días, o hasta que se forme un césped en el plato. A continuación, utilice pequeñas chirridas estériles para desechar las células de la mitad de la placa, y en un tubo, que contiene 35 mililitros de agua estéril.
Repita este proceso para las seis placas restantes, lo que resulta en dos tubos de células en agua. Combine las suspensiones celulares en un solo matraz y mida el od600 de la suspensión, utilizando agua en blanco. Use agua para ajustar la concentración celular hasta que el od600 alcance 44 puntos cuatro por mililitro.
A continuación, prepare las existencias de celdas del congelador y guárdelas a menos 80 grados Centígrados como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, S.Cerevisiae y S.Paradoxus se acoplan para formar un híbrido estéril, que se somete a transposición sobre mutagénesis. Cada clon mutagenizado es un hemizygote, un híbrido diploide en el que se interrumpe un alelo de un gen.
Los hemizygotes se compiten a alta temperatura, y el ADN está aislado de cada cultivo. El ADN es shirred y ligado a adaptadores, y la unión entre el transposon y el genoma se amplifica con una imprimación específica del transposón y una imprimación específica del adaptador. Contando los recuentos de lectura de secuenciación masiva del amplicon, informe de la aptitud de un clon en la población.
Con los resultados en la mano de esta secuenciación, las abundancias de hemizygote para un gen dado, se pueden comparar a las dos temperaturas entre dos clases de hemicizygotes. Clones donde sólo el alelo S.Cerevisiae era de tipo salvaje y funcional, y clones que dependen sólo del alelo S.Paradoxus. En esta implementación representativa, se detectan señales fuertes en ocho genes de limpieza.
En cada caso, las inserciones transposon en el alelo S.Cerevisiae en el híbrido, comprometió el crecimiento a alta temperatura. Estos determinantes candidatos representados bajo del rasgo de la termotolerancia que distingue a S.Cerevisiae de S.Paradoxus. Ahora que hemos completado este experimento, podemos diseccionar otros rasgos que difieren entre estas especies, como la tolerancia al frío o a la sal.
